《DNA的复制、修复与重组DNA技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA的复制、修复与重组DNA技术（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十二章第十二章 DNA DNA的复制、修复与重组的复制、修复与重组转转 录录翻翻 译译复复 制制遗传信息的传递遗传信息的传递遗传信息的表达遗传信息的表达 分子生物学中心法则(centraldogma) 1958 1958年年 CrickCrick 1970 1970年年 TeminTemin和和 BaltimoreBaltimore DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 转 录翻 译逆转录 复 制第一节第一节 DNA DNA复制的原则复制的原则半保留复制(semiconservativereplication)半不连续复制(semi-discontimuousreplication)
2、RNA引物复制起始点和复制方向一、半保留复制一、半保留复制定义：亲代定义：亲代DNADNA分子的两条链可以分别作为模板，分子的两条链可以分别作为模板， 按碱基互补配对原则，指导按碱基互补配对原则，指导DNADNA新链的合成。新合新链的合成。新合成的两个子代成的两个子代DNADNA分子，碱基序列与亲代分子，碱基序列与亲代DNADNA分子完分子完全一样，但一条链来自亲代全一样，但一条链来自亲代DNADNA链，另一条链是新链，另一条链是新合成的合成的DNADNA链。链。二、半不连续复制二、半不连续复制53353555335335定义：定义：DNADNA复制时，一条链是连续复制，另一条链是不复制时，一
3、条链是连续复制，另一条链是不连续复制，称半不连续复制。连续复制，称半不连续复制。前导链前导链(leading strand)(leading strand)：在引物的在引物的33端按端按5 5 3 3 方向方向连续不断地合成的连续不断地合成的DNADNA链。链。随从链随从链(lagging strand)(lagging strand)：在引物的在引物的33端按端按5 3 5 3 方向方向不连续合成的不连续合成的DNADNA链。链。冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）：）：后随链上不连续合成的后随链上不连续合成的1000100020002000或
4、或100 100 200200个核苷酸组个核苷酸组成的成的DNADNA小片段。小片段。三、三、三、三、RNARNARNARNA引物引物引物引物定义：定义：定义：定义：DNADNADNADNA复制时，子链复制时，子链复制时，子链复制时，子链5555端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖端的一段寡聚核糖 核苷酸链，能为核苷酸链，能为核苷酸链，能为核苷酸链，能为DNADNADNADNA聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新聚合酶提供聚合新 的脱氧核的脱氧核的脱氧核的脱氧核糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的糖核苷酸所需的3OH3OH3OH3OH，最后，最后，最后，最后 可被
5、切除。可被切除。可被切除。可被切除。意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的意义：提供新的脱氧核糖核苷酸聚合所需的3OH3OH3OH3OH 保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性保证复制起始部位的真实性35DNADNA模板模板35DNADNA模板模板RNARNARNARNA引物引物引物引物5OH-3RNARNARNARNA引物引物引物引物5OH-33引物酶（引物酶（RNARNA聚合酶）聚合酶）第二节第二节 参与参与DNADNA复制的一些酶类和蛋白质复制的一些酶类和蛋白质一、原核生物大肠埃
6、希菌的一、原核生物大肠埃希菌的DNADNA聚合酶聚合酶1 1、DNADNA聚合酶聚合酶（KornbergKornberg酶）酶） 发现发现:1955:1955年年 Arshur.Kornberg Arshur.Kornberg（阿瑟（阿瑟. .康恩伯格）康恩伯格） 1959 1959年年 诺贝尔生理和医学奖诺贝尔生理和医学奖 活性活性: :大片段大片段 5 5 33聚合酶活性聚合酶活性 和和 3 5 3 5外切酶活性外切酶活性 小片段小片段 5 3 5 3外切酶活性外切酶活性5 35 3外切外切5 35 3聚合聚合3 53 5外切外切NC大片段大片段 Klenow Klenow片段片段小片段小
7、片段罗杰罗杰. .科恩伯格接受父亲（左）的祝贺科恩伯格接受父亲（左）的祝贺 The Nobel Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription Roger D. Kornberg 罗杰罗杰.科恩伯格科恩伯格5 35 3外切酶活性外切酶活性功能：切除功能：切除RNARNA引物引物 切除突变片段，在切除突变片段，在DNADNA损伤修复中起作用损伤修复中起作用5 35 3聚合酶活性聚合酶活性 功能：填补片段切除后的空缺功能：填补片段切除后的空缺3 53 5外切酶活性外切
8、酶活性T5353T功能：校读功能（功能：校读功能（proof readingproof reading）意义：保证意义：保证DNADNA复制的高度真实性复制的高度真实性 DNADNA聚合酶聚合酶 多功能酶多功能酶KlenowKlenow片段片段 常用的工具酶常用的工具酶53352 2、DNADNA聚合酶聚合酶 活性：活性： 5 3 5 3聚合酶活性聚合酶活性 3 5 3 5外切酶活性外切酶活性 功能：功能： 不确切不确切 3 3、DNADNA聚合酶聚合酶组成：多亚基复和物组成：多亚基复和物全酶全酶 核心酶（核心酶（）22 连接二聚体（连接二聚体（2 2） 单个运载夹钳复合物单个运载夹钳复合物（
9、2 2） 4 4 2功能：功能：亚基亚基 5 3 5 3聚合聚合 亚基亚基 3 5 3 5外切外切 亚基亚基 连接连接 2 2亚基复合物亚基复合物 钳夹钳夹 亚基亚基 钳夹、滑动钳夹、滑动 特点：高续进性特点：高续进性 （5050万个脱氧核糖核苷酸）万个脱氧核糖核苷酸） 高效性高效性 （10001000个脱氧核糖核苷酸个脱氧核糖核苷酸/ /秒）秒） 高保真实性（校读功能）高保真实性（校读功能）二、真核生物的二、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶：聚合酶：、五种五种功能：功能：DNADNA聚合酶聚合酶 聚合随从链聚合随从链 DNA DNA聚合酶聚合酶 聚合前
10、导链聚合前导链 （协同增殖细胞核抗原（协同增殖细胞核抗原PCNAPCNA） DNA DNA聚合酶聚合酶 聚合线粒体聚合线粒体DNADNA DNA DNA聚合酶聚合酶、 校读功能、参与校读功能、参与 DNA DNA损伤修复损伤修复三、解链、解旋酶类和蛋白质三、解链、解旋酶类和蛋白质（大肠杆菌（大肠杆菌E.E.colicoli）1 1、DNADNA解链酶解链酶 功能：解开功能：解开DNADNA双链双链 条件：需要条件：需要ATPATP供能供能 ，2 2个个ATP/ATP/对碱基对碱基 2 2、单链、单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 功能：维持模板单链状态功能：维持模板单链状态 保护模板不受核酸酶水
11、解保护模板不受核酸酶水解 DNA DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 功能：暂时切断双链中的一股，功能：暂时切断双链中的一股， 另一另一股链旋转通过该缺口，股链旋转通过该缺口， 张力张力下降后，再连接缺口下降后，再连接缺口 DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 功能：暂时切断双链中的两股，功能：暂时切断双链中的两股， 断端旋转，断端旋转，张力下降后，张力下降后，再连接缺口再连接缺口 条件：需要条件：需要ATPATP供供能能3 3、DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶4 4、引发体、引发体组分：组分：DnaA DnaA 辨认并结合至复制起始部位辨认并结合至复制起始部位 DnaB DnaB 解链酶作用解链酶作用
12、DnaC DnaC 帮助帮助DnaBDnaB结合至复制起始部位结合至复制起始部位 引物酶引物酶 RNA RNA聚合酶，合成聚合酶，合成RNARNA引物引物5 5、连接酶、连接酶功能：催化两段功能：催化两段DNADNA链间形成链间形成3 53 5磷酸二酯键磷酸二酯键特点：只能催化双链特点：只能催化双链DNADNA链上的一股或两股链的连接链上的一股或两股链的连接555533555533355555555553333第三节第三节 DNA DNA复制过程（复制过程（大肠埃希菌）大肠埃希菌）模板：单链模板：单链DNADNA引物：引物：RNARNA引物引物原料：原料：dNTPdNTP（dATPdATP、
13、dGTP dGTP、 dCTP dCTP、 dTTP dTTP ）聚合酶：聚合酶：DNADNA聚合酶聚合酶辅助因子：辅助因子：MgMg2 2其它：酶和蛋白因子其它：酶和蛋白因子方向：方向：5 35 3一、复制的起始一、复制的起始1 1、复制起始部位、复制起始部位orioriC C 单一：原核生物通常只有一个复制起始点单一：原核生物通常只有一个复制起始点 特定：高度保守序列特定：高度保守序列 GATCGATCTNTTNTTTTTNTTNTTTT DnaADnaA结合位点结合位点 真核生物有多个复制起始点真核生物有多个复制起始点GATCGATCTNTTNTTTTTNTTNTTTTTTATCCACA
14、TTATCCACADnaADnaADnaADnaADnaA:DnaA: 结合至结合至orioriC C的的4 4个个DnaADnaA结合位点，形成起始复合物结合位点，形成起始复合物 作用于作用于orioriC C的的3 3个个13bp13bp序列，序列，DNADNA在此处解链，在此处解链， 形成开放型起始复合物形成开放型起始复合物DnaC:DnaC:DnaB:DnaB: 解开复制起始部位的解开复制起始部位的DNADNA双链双链 帮助帮助DnaBDnaB结合至复制起始部位结合至复制起始部位单链结合蛋白：单链结合蛋白： 稳定并保护已解开的稳定并保护已解开的DNADNA单链单链引物酶：引物酶： RN
15、A RNA聚合酶，合成聚合酶，合成RNARNA引物引物 维持模板单链状态维持模板单链状态2 2、复制方向、复制方向双向复制双向复制复制眼（泡）：复制眼（泡）：DNADNA复制时，局部解开复制时，局部解开DNADNA的双链，的双链，在电镜下呈眼泡状突起在电镜下呈眼泡状突起复制叉：复制叉：DNADNA复制时，局部复制时，局部DNADNA双链解开，在复制双链解开，在复制前进部位两侧形成的前进部位两侧形成的Y Y型或叉状结构型或叉状结构真核生物真核生物DNADNA复制复制原核生物原核生物DNADNA复制复制二、复制的延长二、复制的延长DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶 解旋解旋DNADNA聚合酶聚合酶
16、催化催化3 53 5磷酸二酯键形成，聚合磷酸二酯键形成，聚合DNADNA新链新链复制叉前进复制叉前进“前导链和随从链同时同方向合成前导链和随从链同时同方向合成”问题的解决问题的解决 随从链摸板环绕随从链摸板环绕二、复制的终止二、复制的终止DNADNA聚合酶聚合酶切除引物切除引物填补空缺填补空缺53333555DNADNA连接酶连接酶连接前后两个片段间的缺口连接前后两个片段间的缺口53333555四、真核生物端粒四、真核生物端粒DNADNA的复制的复制1 1、端粒：真核生物线性、端粒：真核生物线性DNADNA的两个末端的两个末端 结构：由数百个串联排列的结构：由数百个串联排列的GTGT丰富的寡聚
17、核苷酸序列组成丰富的寡聚核苷酸序列组成 人人 (AGGGTT)n (AGGGTT)n 四膜虫四膜虫 (GGGGTT)n (GGGGTT)n 功能：维持染色体功能：维持染色体DNADNA的稳定性的稳定性2 2、端粒酶：防止端粒缩短的一种逆转录酶、端粒酶：防止端粒缩短的一种逆转录酶 组成：由组成：由RNARNA和蛋白质组成和蛋白质组成 蛋白质蛋白质 DNA DNA聚合酶聚合酶 RNA RNA 模板模板 唯一携带唯一携带RNARNA模板的逆转录酶模板的逆转录酶 功能：复制端粒序列，防止端粒缩短。功能：复制端粒序列，防止端粒缩短。 机制：机制：端粒、端粒酶与肿瘤：端粒、端粒酶与肿瘤：生殖细胞、干细胞：
18、端粒酶活性保持生殖细胞、干细胞：端粒酶活性保持体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形 成恶性增殖成恶性增殖 1994 1994年，年，Couter Couter 人卵巢细胞人卵巢细胞 端粒酶表达端粒酶表达 1997 1997年，人端粒酶基因克隆年，人端粒酶基因克隆 85% 85%肿瘤细胞中端粒酶活性升高肿瘤细胞中端粒酶活性升高第四节第四节 DNA DNA的损伤与修复的损伤与修复一、一、 DNA DNA损伤的因素损伤的因素1 1、自发因素、自发因素 环境中溶剂分子随即
19、热碰撞环境中溶剂分子随即热碰撞 N- N-糖苷键断裂，糖苷键断裂，A A、G G脱落脱落磷磷 酸酸戊戊 糖糖碱碱 基基2 2、物理因素、物理因素 紫外线紫外线 电离辐射电离辐射 共价交联，嘧啶二聚体共价交联，嘧啶二聚体 单（双）链断裂，碱基脱落破坏，分子交联，脱氧核糖破坏单（双）链断裂，碱基脱落破坏，分子交联，脱氧核糖破坏3 3、化学因素、化学因素 亚硝酸盐亚硝酸盐 C U C U二、二、 DNA DNA损伤的类型损伤的类型1 1、点突变、点突变 转换转换 同型碱基同型碱基 颠换颠换 异型碱基异型碱基 调控序列调控序列 影响基因表达影响基因表达 编码序列编码序列 有意突变有意突变 改变蛋白质功
20、能改变蛋白质功能 无意突变无意突变 个别氨基酸改变，蛋白质功能不变个别氨基酸改变，蛋白质功能不变 静止突变静止突变 个别碱基改变，氨基酸不变个别碱基改变，氨基酸不变镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血N - Val . His . Leu . Thr . Pro . Glu . Glu .- C N - Val . His . Leu . Thr . Pro . Val . Glu .- C 5 - * . * . * . * . * . CTC . *- 35 - * . * . * . * . * . CAC . *- 32 2、缺失、缺失 一个核苷酸、一段核苷酸、一个基因一个核苷酸、一段核苷
21、酸、一个基因 Lesch-Nyhans Lesch-Nyhans综合症综合症 次黄嘌呤次黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRTHGPRT）基因丢失）基因丢失3 3、插入、插入 一个碱基、一段核苷酸一个碱基、一段核苷酸 芳香族分子等芳香族分子等 移码突变移码突变4 4、倒位、倒位二、二、DNADNA损伤的修复机制损伤的修复机制1 1、光修复机制、光修复机制 低等生物低等生物 解聚嘧啶二聚体解聚嘧啶二聚体 不需要光复活酶不需要光复活酶 需要光复活酶需要光复活酶2 2、切除修复机制（暗修复）、切除修复机制（暗修复） 所有生物所有生物 切割切割3535磷酸二酯键（扩创）、填
22、补、连接磷酸二酯键（扩创）、填补、连接 UV UV特异的核酸内切酶特异的核酸内切酶 着色性干皮病着色性干皮病 APAP特异的核酸内切酶特异的核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶I I（5353外切）外切）PPPPOOOO53 DNADNA聚合酶聚合酶I I（5353聚合）聚合）3 3 3 3、碱基切除修复机制、碱基切除修复机制、碱基切除修复机制、碱基切除修复机制 DNA糖苷酶糖苷酶 DNADNA 连接酶连接酶 切割错误碱基切割错误碱基 切割切割3535磷酸二酯键磷酸二酯键 切除、切除、填补填补 连接连接DNA糖苷酶糖苷酶：特异识别一种：特异识别一种DNA分子中改变的碱基，分子中改变的碱基， 并
23、水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键并水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键,形成形成AP位点。位点。AP特异的核酸内切酶特异的核酸内切酶：切割：切割35磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶I：切除损伤链，填补缺口：切除损伤链，填补缺口连接酶连接酶：连接切口：连接切口为什么组成为什么组成DNADNA是是A AT TCGCG，而组成，而组成RNARNA是是A AU UCG CG ？ 尿嘧啶尿嘧啶-DNA-DNA糖苷酶的发现糖苷酶的发现 尿嘧啶尿嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶5C5C甲基化甲基化5C5C去甲基去甲基 “区分正常的尿嘧啶与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶区分正常的尿嘧啶与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶”的需要的需要455
24、111复制的真实性复制的真实性复制的真实性复制的真实性1 1 1 1、半保留复制、半保留复制、半保留复制、半保留复制2 2 2 2、碱基互补配对原则、碱基互补配对原则、碱基互补配对原则、碱基互补配对原则3 3 3 3、RNARNARNARNA引物引物引物引物4 4 4 4、DNADNADNADNA聚合酶：校读功能聚合酶：校读功能聚合酶：校读功能聚合酶：校读功能5 5 5 5、端粒与端粒酶、端粒与端粒酶、端粒与端粒酶、端粒与端粒酶6 6 6 6、DNADNADNADNA的损伤修复机制的损伤修复机制的损伤修复机制的损伤修复机制7 7 7 7、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶-DNA-DNA-DNA-
25、DNA糖苷酶糖苷酶糖苷酶糖苷酶 DNA DNA DNA DNA（T T T T） RNA RNA RNA RNA（U U U U）第五节第五节 重组重组DNADNA技术技术 1 1 1 1、DNADNADNADNA重组：指两个重组：指两个重组：指两个重组：指两个DNADNADNADNA分子之间，或一个分子之间，或一个分子之间，或一个分子之间，或一个DNADNADNADNA分子的两个不分子的两个不分子的两个不分子的两个不同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的同部位之间，通过链断裂
26、和片段的交换重接，改变了基因的组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的不同物种的不同物种的不同物种的DNADNADNADNA分子间。分子间。分子间。分子间。 2 2 2 2、DNADNADNADNA重组技术：重组技术：重组技术：重组技术： 在实验室内，用人工方法将不同来源在实验室内，用人工方法将不同来源在实验室内，用人工方法将不同来源在实验室内，用人工方法将不同来源的的的的DNADNADNADNA分子拼接成一个重组分子
27、拼接成一个重组分子拼接成一个重组分子拼接成一个重组(recombinant) DNA(recombinant) DNA(recombinant) DNA(recombinant) DNA分子，并将其分子，并将其分子，并将其分子，并将其引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为DNADNADNADNA重组重组重组重组技术或基因工程。技术或基因工程。技术或基因工程。技术或基因工程。3 3、重组、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤（1 1 1 1）重
28、组分子的构建（接）重组分子的构建（接）重组分子的构建（接）重组分子的构建（接）（2 2 2 2）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转） 转化转化转化转化 转染转染转染转染 感染感染感染感染（3 3 3 3）筛选（筛）筛选（筛）筛选（筛）筛选（筛）（1 1 1 1）重组分子的构建（接）重组分子的构建（接）重组分子的构建（接）重组分子的构建（接） 目的基因或目的目的基因或目的DNADNA片段的获得片段的获得 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR polymerase chain reaction, PCR ） 原
29、理：模拟体内原理：模拟体内DNADNA复制复制 过程：过程：9494变性变性 58 58退火退火 72 72延伸延伸 条件：条件： DNA DNA模板：单链模板：单链DNADNA 寡聚核苷酸引物：按要求设计寡聚核苷酸引物：按要求设计 Taq DNA Taq DNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 辅助因子：辅助因子： Mg2+ Mg2+ 原料：原料：dNTPdNTP 缓冲体系：合适的反应条件，如缓冲体系：合适的反应条件，如PHPH、离子强度、离子强度 载体载体质粒（质粒（plasmidplasmid）：细菌染色体外的双链环状）：细菌染色体外的双链环状DNADNA分子，分子，
30、能自主复制，有抗药性基因以便筛选。能自主复制，有抗药性基因以便筛选。 限制性内切酶：微生物产生的，能识别双链限制性内切酶：微生物产生的，能识别双链DNADNA分子中分子中某一特异碱基顺序（约某一特异碱基顺序（约4-64-6个碱基），并切开磷酸二酯键个碱基），并切开磷酸二酯键的酶。的酶。 EcoRIEcoRI回文结构回文结构5 - G A A T T C 3 5 - G A A T T C 3 3 - C T T A A G - 5 3 - C T T A A G - 5 5 - G 5 - G 3 - C T T A A 5 3 - C T T A A 5 A A T T C 3 A A T
31、T C 3 G - 5 G - 5 +（2 2 2 2）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转）引入宿主细胞（转）转化：将重组转化：将重组转化：将重组转化：将重组DNADNADNADNA分子，如带有外源基因的质粒，分子，如带有外源基因的质粒，分子，如带有外源基因的质粒，分子，如带有外源基因的质粒， 引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在原核细胞内引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在原核细胞内引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在原核细胞内引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在原核细胞内复制或表达。复制或表达。复制或表达。复制或表达。（3 3 3 3）筛选（筛）筛选（筛）筛选（筛）筛选（筛）抗药性标记：四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等抗药性标记：四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等抗药性标记：四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等抗药性标记：四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等
