实验三实验三 蛋白质定量分析蛋白质定量分析 ——双缩双缩脲法脲法 【【目的要求目的要求】】•1.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、技术和特点意义•2.掌握运用标准曲线法求算待测溶液的浓度•3.进一步巩固分光光度计和刻度吸管的使用 【【实验原理实验原理】】•双缩脲反应： 方法方法灵敏度灵敏度时间原理原理干干扰物物质说明明凯氏定氮法氏定氮法（（Kjedahl法）法）灵敏度低，灵敏度低，适用于适用于0.2~ 1.0mg氮，氮，误差差为 2％％费时 8～～10小小时将蛋白氮将蛋白氮转化化为氨，用酸吸氨，用酸吸收后滴定收后滴定非蛋白氮非蛋白氮（可用三（可用三氯乙酸沉淀蛋乙酸沉淀蛋白白质而分离）而分离）用于用于标准蛋白准蛋白质含量的准确含量的准确测定；干定；干扰少；少；费时太太长双双缩脲法法（（Biuret法）法）灵敏度低灵敏度低1～～10mg中速中速 20~30分分钟多多肽键＋碱性＋碱性Cu2＋＋紫色紫色络合物合物硫酸硫酸铵；；Tris缓冲液；冲液；某些氨基酸某些氨基酸用于快速用于快速测定，定，但不太灵敏；但不太灵敏；不同蛋白不同蛋白质显色相似色相似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏灵敏50～～100 g快速快速 5～～10分分钟蛋白蛋白质中的中的酪酪氨酸氨酸和和色氨酸色氨酸残基在残基在280nm处的光吸收的光吸收各种各种嘌嘌吟和吟和嘧啶；；各种核苷酸各种核苷酸用于用于层析柱流析柱流出液的出液的检测；；核酸的吸收可核酸的吸收可以校正以校正Folin－酚－酚试剂法法（（Lowry法）法）灵敏度高灵敏度高～～5 g慢速慢速 40～～60分分钟 双双缩脲反反应；；磷磷钼酸－磷酸－磷钨酸酸试剂被酪氨被酪氨酸和苯丙氨酸酸和苯丙氨酸还原原硫酸硫酸铵；；Tris缓冲液；冲液；甘氨酸；甘氨酸；各种硫醇各种硫醇耗耗费时间长；；操作要操作要严格格计时；；颜色深浅随不色深浅随不同蛋白同蛋白质变化化考考马斯亮斯亮蓝法法(Bradford法法)灵敏度最高灵敏度最高1～～5 g快速快速5～～15分分钟考考马斯亮斯亮蓝染染料与蛋白料与蛋白质结合合时，其，其 max由由465nm变为595nm强强碱性碱性缓冲冲液；液；TritonX-100;SDS最好的方法；最好的方法；干干扰物物质少；少；颜色色稳定；定； 颜色深浅随不色深浅随不同蛋白同蛋白质变化化 •1.加液加液 取10mL试管7支，标明管号，按下表所示，加入试剂。
操作步骤操作步骤】】 管号管号试剂试剂 0 1 2 3 4 5 6 酶蛋白标准蛋白溶液酶蛋白标准蛋白溶液（（mL））10mg/mL — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 —待测蛋白液（待测蛋白液（mL）） — — — — — — 1.0蒸馏水（蒸馏水（mL）） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — —蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mL）） 0 2.0 4.0 6.0 8.010.0未知未知 2.各管混匀后加入双缩脲试剂各管混匀后加入双缩脲试剂4.0ml，充分混匀；，充分混匀；3.室温（室温（20-25度）度）20min；；4.在在540nm 处以处以0号管号管调零点测定各管吸光度；调零点测定各管吸光度；5.绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；横坐标；6.对照标准曲线，求待测蛋白质浓度对照标准曲线，求待测蛋白质浓度 作图作图 以各管蛋白质浓度（mg/mL)为横坐标，吸光度(A540)为纵坐标，选择适当的纵横坐标分度值，在座标纸上便可绘出一条蛋白质双缩脲剂量的反应标准曲线（standard curve)。
注意事项 1. 用移液管准确移取溶液，可以采用差量法，溶液尽量放入试管底部 2. 试管应编号，注意加样顺序，不要漏加 3. 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内 管号管号吸光度（吸光度（A540) 0 1 2 3 4 5 6 A1A2A3A平均平均双缩脲法测定蛋白浓度双缩脲法测定蛋白浓度 •【【思考题思考题】】•1、干扰本实验的因素有哪些？、干扰本实验的因素有哪些？•2、是否所有的肽和蛋白质都能和硫酸铜的碱、是否所有的肽和蛋白质都能和硫酸铜的碱性溶液发生双缩脲反应？性溶液发生双缩脲反应？ 。
