第二节第二节 分配色谱分配色谱1 一、基本原理一、基本原理1、吸附色谱的局限性、吸附色谱的局限性–（（（（1 1）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物）吸附色谱不适合于分离强极性的亲水性物质（成分）；质（成分）；质（成分）；质（成分）；–（（（（2 2）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响）吸附剂的含水量对吸附剂的吸附能力影响较大，常使结果重现性较差；较大，常使结果重现性较差；较大，常使结果重现性较差；较大，常使结果重现性较差；–（（（（3 3）易出现拖尾峰易出现拖尾峰易出现拖尾峰易出现拖尾峰2 ٭2 2、分配色谱原理、分配色谱原理、分配色谱原理、分配色谱原理– –（（（（1 1）固定相为液体）固定相为液体）固定相为液体）固定相为液体• •将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为固定相固定相固定相固定相。
• •吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫吸附剂颗粒表面或纸纤维叫载体或担体载体或担体载体或担体载体或担体• •根据组分在两相中的根据组分在两相中的根据组分在两相中的根据组分在两相中的溶解度不同溶解度不同溶解度不同溶解度不同而分离– –（（（（2 2））））“ “相似相溶相似相溶相似相溶相似相溶” ”原则原则原则原则• •极性物质在极性溶剂中溶解度大，极性物质在极性溶剂中溶解度大，极性物质在极性溶剂中溶解度大，极性物质在极性溶剂中溶解度大，K K大；大；大；大；• •非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，非极性物质在非极性溶剂中溶解度大，K K大– –（（（（3 3）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线）分配定律与分配等温线– –（（（（4 4）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：）分配色谱的特点：• •a a、重现性、重现性、重现性、重现性 • •b b、峰对称、峰对称、峰对称、峰对称• •c c、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象、无强烈滞留现象. .٭ ٭几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性几乎适用于各种类型的化合物，特别适宜于亲水性物质，如极性较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等。
较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等较大的生物碱、苷类、有机酸、糖类及氨基酸的衍生物等3 二、载体٭只起负载固定相的作用只起负载固定相的作用٭要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒要求：惰性、无吸附能力、纯净、颗粒均匀٭种类种类 1）硅胶：重现性差）硅胶：重现性差 2）硅藻土：应用最多）硅藻土：应用最多 3）纤维素：纸色谱）纤维素：纸色谱4 三、固定相和流动相的选择٭正相分配色谱：正相分配色谱：正相分配色谱：正相分配色谱：固定相的极性固定相的极性固定相的极性固定相的极性大于大于大于大于流动相的极流动相的极流动相的极流动相的极性；性；性；性；– –固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、缓冲溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱按一定的比例与载体混匀后填装于色谱柱– –流动相：石油醚等流动相：石油醚等流动相：石油醚等流动相：石油醚等–洗脱顺序洗脱顺序洗脱顺序洗脱顺序: :极性大极性大极性大极性大的组分的组分的组分的组分保留作用强保留作用强保留作用强保留作用强；极性小；极性小；极性小；极性小的组分保留作用弱的组分保留作用弱的组分保留作用弱的组分保留作用弱 5 ٭反相分配色谱反相分配色谱：固定相的极性：固定相的极性小于小于流动相流动相的极性。
的极性–固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶固定液：硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂–流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲流动相：水、各种水溶液（酸、碱、盐及缓冲液）、与水混合的有机溶剂液）、与水混合的有机溶剂液）、与水混合的有机溶剂液）、与水混合的有机溶剂–洗脱顺序洗脱顺序洗脱顺序洗脱顺序: :极性小极性小极性小极性小的组分的组分的组分的组分保留作用强保留作用强保留作用强保留作用强；极性大的；极性大的；极性大的；极性大的组分保留作用弱组分保留作用弱组分保留作用弱组分保留作用弱6 四、分配色谱操作注意事项四、分配色谱操作注意事项1 1、两相溶剂的处理、两相溶剂的处理、两相溶剂的处理、两相溶剂的处理2 2、上样量与样品前处理上样量与样品前处理上样量与样品前处理上样量与样品前处理3 3、柱色谱、柱色谱、柱色谱、柱色谱4 4、纸色谱、纸色谱、纸色谱、纸色谱7 第三节第三节 离子交换色谱法离子交换色谱法(ion exchange chromatography)一、基本原理一、基本原理–1 1、离子交换剂与离子交换过程、离子交换剂与离子交换过程、离子交换剂与离子交换过程、离子交换剂与离子交换过程• •（（（（1 1）离子交换剂）离子交换剂）离子交换剂）离子交换剂– –为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗为一种固体状可在水溶液中浸润和溶胀的多孔颗粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，粒，其表面有许多可电离的基团，在水中电离时，有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固有一种离子可在水中自由移动，而另一种则在固定相上不能自由移动。
定相上不能自由移动定相上不能自由移动定相上不能自由移动– –可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即可自由移动的离子可以被其它同类离子置换，即离子交换离子交换离子交换离子交换8 •（（（（2 2）离子交换过程）离子交换过程）离子交换过程）离子交换过程– –水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子水溶液中（流动相中）的各种离子，可与离子交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其交换树脂上固定的离子基团结合，使原来与其结合的离子被置换，进入流动相而发生置换结合的离子被置换，进入流动相而发生置换结合的离子被置换，进入流动相而发生置换结合的离子被置换，进入流动相而发生置换– –带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧带负电的交换基团（固定的离子基团，如磺酸基、羧酸基）：用于阳离子分离；酸基）：用于阳离子分离；酸基）：用于阳离子分离；酸基）：用于阳离子分离；– –带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：带正电的交换基团（固定的离子基团，如季胺盐）：用于阴离子分离。
用于阴离子分离用于阴离子分离用于阴离子分离 9 –2 2、分离机理、分离机理、分离机理、分离机理• •（（（（1 1）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而）不同的离子与交换树脂的结合力不同，从而固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移固定相对它的保留能力不同，从而造成差速迁移• •（（（（2 2）离子交换平衡：）离子交换平衡：）离子交换平衡：）离子交换平衡： K K K K 大，大，大，大，Na+Na+Na+Na+易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢；易与固定相结合，移动慢； 反之，移动快反之，移动快反之，移动快反之，移动快t tR R = t= tmm(1+K’)(1+K’)V VR R = V= Vmm(1+K’) = V(1+K’) = Vmm+KV+KVS SK’K’K’K’为分配系数为分配系数为分配系数为分配系数平衡时平衡时平衡时平衡时 K 为选择性系数为选择性系数 （交换平衡常数）（交换平衡常数）10 二、离子交换树脂二、离子交换树脂1 1、离子交换树脂的构成、离子交换树脂的构成、离子交换树脂的构成、离子交换树脂的构成– –由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的网状结构，不溶于水和有机溶剂，性质稳定。
水和有机溶剂，性质稳定水和有机溶剂，性质稳定水和有机溶剂，性质稳定 苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；苯乙烯组成长链；二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂二乙烯基苯为交联剂 11 2、离子交换树脂的类型、离子交换树脂的类型（（（（1 1）阳离子交换树脂）阳离子交换树脂）阳离子交换树脂）阳离子交换树脂 — — 可交换的离子为阳离子可交换的离子为阳离子可交换的离子为阳离子可交换的离子为阳离子• •氢型、钠型氢型、钠型氢型、钠型氢型、钠型 • •强酸型、弱酸型、中强酸型（－强酸型、弱酸型、中强酸型（－强酸型、弱酸型、中强酸型（－强酸型、弱酸型、中强酸型（－COOHCOOH、－、－、－、－POPO3 3H H、、、、－－－－SHSH）））） 例如：磺酸型例如：磺酸型例如：磺酸型例如：磺酸型 R-SO R-SO3 3－－－－H H+ + (pH (pH范围宽范围宽范围宽范围宽) ) ** ** 应注意应注意应注意应注意pHpH范围，否则交换容量急剧下降范围，否则交换容量急剧下降范围，否则交换容量急剧下降。
范围，否则交换容量急剧下降2 2）阴离子交换树脂）阴离子交换树脂）阴离子交换树脂）阴离子交换树脂 — — 可交换的离子为阴离子可交换的离子为阴离子可交换的离子为阴离子可交换的离子为阴离子• •按不同碱性分：按不同碱性分：按不同碱性分：按不同碱性分： 强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）强碱型（季胺基团）—NR—NR3 3+ + (pH<11) (pH<11) －－－－NHNH2 2, , －－－－NHR,NHR,－－－－NRNR2 2等等等等 (pH<8) (pH<8)• •按可交换的离子分：氢氧型、氯型按可交换的离子分：氢氧型、氯型按可交换的离子分：氢氧型、氯型按可交换的离子分：氢氧型、氯型12 3、离子交换树脂的特性、离子交换树脂的特性–①①①① 交联度：表示交联剂在离子交换树脂中所占交联度：表示交联剂在离子交换树脂中所占交联度：表示交联剂在离子交换树脂中所占交联度：表示交联剂在离子交换树脂中所占的百分含量，通常使用的百分含量，通常使用的百分含量，通常使用的百分含量，通常使用4 4～～～～12%12%的树脂• •交联度大：树脂孔小，刚性强，孔穴多，离子基团交联度大：树脂孔小，刚性强，孔穴多，离子基团交联度大：树脂孔小，刚性强，孔穴多，离子基团交联度大：树脂孔小，刚性强，孔穴多，离子基团多，溶胀小。
多，溶胀小多，溶胀小多，溶胀小– – 适合于体积较小的无机离子的分离适合于体积较小的无机离子的分离适合于体积较小的无机离子的分离适合于体积较小的无机离子的分离• •交联度小：树脂孔大，刚性差，渗透性好交联度小：树脂孔大，刚性差，渗透性好交联度小：树脂孔大，刚性差，渗透性好交联度小：树脂孔大，刚性差，渗透性好– – 适合于体积较大的有机离子的分离适合于体积较大的有机离子的分离适合于体积较大的有机离子的分离适合于体积较大的有机离子的分离–②②②② 溶胀：树脂内极性基团吸水性极强，大量的溶胀：树脂内极性基团吸水性极强，大量的溶胀：树脂内极性基团吸水性极强，大量的溶胀：树脂内极性基团吸水性极强，大量的水进入树脂内部，产生膨胀，叫溶胀水进入树脂内部，产生膨胀，叫溶胀水进入树脂内部，产生膨胀，叫溶胀水进入树脂内部，产生膨胀，叫溶胀• •溶胀程度与树脂类型、交联度有关溶胀程度与树脂类型、交联度有关溶胀程度与树脂类型、交联度有关溶胀程度与树脂类型、交联度有关• • 因此，严禁干法装柱因此，严禁干法装柱因此，严禁干法装柱因此，严禁干法装柱13 –③③③③ 交换容量：每克干树脂中真正参加交换反应交换容量：每克干树脂中真正参加交换反应交换容量：每克干树脂中真正参加交换反应交换容量：每克干树脂中真正参加交换反应的基团数。
的基团数的基团数的基团数• •常用单位：常用单位：常用单位：常用单位：mmol/g,mmol/mlmmol/g,mmol/ml等等等等• •影响因素：影响因素：影响因素：影响因素：pHpH、交联度、溶胀特性、分离对象，只、交联度、溶胀特性、分离对象，只、交联度、溶胀特性、分离对象，只、交联度、溶胀特性、分离对象，只能以实际测量为准能以实际测量为准能以实际测量为准能以实际测量为准–④④④④ 粒度：离子交换树脂颗粒的大小（指溶胀状粒度：离子交换树脂颗粒的大小（指溶胀状粒度：离子交换树脂颗粒的大小（指溶胀状粒度：离子交换树脂颗粒的大小（指溶胀状态）态）态）态）14 三、经验规则（亲和力大小规则）三、经验规则（亲和力大小规则）–对小离子亲合力大对小离子亲合力大对小离子亲合力大对小离子亲合力大• •水合离子半径越小，亲合力越大水合离子半径越小，亲合力越大水合离子半径越小，亲合力越大水合离子半径越小，亲合力越大–对电荷多的离子亲合力大对电荷多的离子亲合力大对电荷多的离子亲合力大对电荷多的离子亲合力大• • A A4+4+ > B > B3+3+ > C > C2+2+ > D > D+ +–大分子量的有机离子大分子量的有机离子大分子量的有机离子大分子量的有机离子, ,有较高的亲和力有较高的亲和力有较高的亲和力有较高的亲和力 15 四、流动相四、流动相1 1、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定、组成：一般为盐类的缓冲水溶液（有一定的的的的pHpH值）。
值）2 2、对分离的影响、对分离的影响、对分离的影响、对分离的影响16 2、对分离的影响、对分离的影响–①①①①流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对流动相主要影响组分离子和交换基团形成离子对的过程的过程的过程的过程–②②②② pH pH对弱酸、弱碱的影响对弱酸、弱碱的影响对弱酸、弱碱的影响对弱酸、弱碱的影响•影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程影响其离解平衡，即控制了组分形成离子的程度：度：度：度： [ [离子离子离子离子] ]组分组分组分组分↑↑↑↑，则，则，则，则K’K’↑↑↑↑；；；； [ [离子离子离子离子] ]组分组分组分组分↓↓↓↓，则，则，则，则K’ K’ ↓↓↓↓•不同离子交换剂的不同离子交换剂的不同离子交换剂的不同离子交换剂的pHpH适用范围：适用范围：适用范围：适用范围：强酸型：较宽强酸型：较宽强酸型：较宽强酸型：较宽; ; 强碱型：强碱型：强碱型：强碱型：pH<11; pH<11; 弱酸型弱酸型弱酸型弱酸型:pH>6; :pH>6; 弱碱型：弱碱型：弱碱型：弱碱型：pH<8pH<817 – –③③③③ 离子强度的影响离子强度的影响离子强度的影响离子强度的影响( (盐类浓度盐类浓度盐类浓度盐类浓度) )• •离子强度离子强度离子强度离子强度↑↑↑↑，溶剂强度，溶剂强度，溶剂强度，溶剂强度↑↑↑↑，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力↑↑↑↑。
– –④④④④ 平衡离子平衡离子平衡离子平衡离子( (即流动相中的盐类即流动相中的盐类即流动相中的盐类即流动相中的盐类) )的影响的影响的影响的影响• •它的种类可影响分离的选择性，浓度影响溶剂强度；它的种类可影响分离的选择性，浓度影响溶剂强度；它的种类可影响分离的选择性，浓度影响溶剂强度；它的种类可影响分离的选择性，浓度影响溶剂强度；它们与树脂的亲合力不同，从而影响组分的相对保它们与树脂的亲合力不同，从而影响组分的相对保它们与树脂的亲合力不同，从而影响组分的相对保它们与树脂的亲合力不同，从而影响组分的相对保留值：留值：留值：留值：– –a. a. 离子浓度相同时，高电荷离子与交换基团亲合离子浓度相同时，高电荷离子与交换基团亲合离子浓度相同时，高电荷离子与交换基团亲合离子浓度相同时，高电荷离子与交换基团亲合力大力大力大力大– –b. b. 同价离子，原子量增大亲和力增加同价离子，原子量增大亲和力增加同价离子，原子量增大亲和力增加同价离子，原子量增大亲和力增加– –c. c. 水合离子半径越小，亲和力越大水合离子半径越小，亲和力越大水合离子半径越小，亲和力越大水合离子半径越小，亲和力越大。
18 3、流动相的选择（淋洗液）、流动相的选择（淋洗液）–①①①① 用去离子水溶解淋洗剂配制而成用去离子水溶解淋洗剂配制而成用去离子水溶解淋洗剂配制而成用去离子水溶解淋洗剂配制而成• •淋洗剂为电解质（含阳离子、阴离子），其中对分离淋洗剂为电解质（含阳离子、阴离子），其中对分离淋洗剂为电解质（含阳离子、阴离子），其中对分离淋洗剂为电解质（含阳离子、阴离子），其中对分离起实际作用的称淋洗离子：起实际作用的称淋洗离子：起实际作用的称淋洗离子：起实际作用的称淋洗离子：• •如如如如NaCONaCO3 3水溶液为流动相，分离无机阴离子时，水溶液为流动相，分离无机阴离子时，水溶液为流动相，分离无机阴离子时，水溶液为流动相，分离无机阴离子时，NaNa2 2COCO3 3是淋洗剂，是淋洗剂，是淋洗剂，是淋洗剂，COCO3 32 2－－－－是淋洗离子是淋洗离子是淋洗离子是淋洗离子–②②②② 选择的基本原则：选择的基本原则：选择的基本原则：选择的基本原则：• •理论上：淋洗离子与树脂的亲和力应接近或稍高于被理论上：淋洗离子与树脂的亲和力应接近或稍高于被理论上：淋洗离子与树脂的亲和力应接近或稍高于被理论上：淋洗离子与树脂的亲和力应接近或稍高于被测离子。
测离子• •实际：样品组分中有强保留离子和弱离子时，若选择实际：样品组分中有强保留离子和弱离子时，若选择实际：样品组分中有强保留离子和弱离子时，若选择实际：样品组分中有强保留离子和弱离子时，若选择与保留最强的离子的亲和力接近的淋洗离子，弱保留与保留最强的离子的亲和力接近的淋洗离子，弱保留与保留最强的离子的亲和力接近的淋洗离子，弱保留与保留最强的离子的亲和力接近的淋洗离子，弱保留的离子会很快流出色谱柱，不能达到分离的离子会很快流出色谱柱，不能达到分离的离子会很快流出色谱柱，不能达到分离的离子会很快流出色谱柱，不能达到分离• •所以根据样品组成，通过实验选择所以根据样品组成，通过实验选择所以根据样品组成，通过实验选择所以根据样品组成，通过实验选择19 五、应用五、应用1 1、除去干扰离子、除去干扰离子、除去干扰离子、除去干扰离子2 2、测定盐类含量、测定盐类含量、测定盐类含量、测定盐类含量3 3、痕量元素富集、痕量元素富集、痕量元素富集、痕量元素富集20 第四节第四节 空间排阻色谱空间排阻色谱（凝胶色谱）（凝胶色谱）٭ ٭ 利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）利用大小不同的分子在多孔固定相（凝胶）中的选择性渗透来分离。
中的选择性渗透来分离中的选择性渗透来分离中的选择性渗透来分离 适用于分离分子量不同的大分子物质（适用于分离分子量不同的大分子物质（适用于分离分子量不同的大分子物质（适用于分离分子量不同的大分子物质（Mr Mr >2000>2000））））21 一、基本原理一、基本原理一、基本原理一、基本原理– –1 1、分离机理、分离机理、分离机理、分离机理• •（（（（1 1）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；）前三种是亲和力不同而分离；• •（（（（2 2）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根）凝胶色谱中组分与固定相之间无作用力，只是根据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；据分子量大小来分离；• •（（（（3 3）凝胶）凝胶）凝胶）凝胶 — — 有一定的孔径分布范围的多孔物质组有一定的孔径分布范围的多孔物质组有一定的孔径分布范围的多孔物质组有一定的孔径分布范围的多孔物质组分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决分进入柱内后，全向固定相的孔中扩散，保留程度取决于孔和组分分子的大小。
于孔和组分分子的大小于孔和组分分子的大小于孔和组分分子的大小– –小分子小分子小分子小分子: :将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中将全部渗入细孔中, ,在流经柱时在流经柱时在流经柱时在流经柱时, ,经历的路程最长经历的路程最长经历的路程最长经历的路程最长. .– –中等大小分子中等大小分子中等大小分子中等大小分子: :渗入部分较大的孔隙渗入部分较大的孔隙渗入部分较大的孔隙渗入部分较大的孔隙, ,而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥而被较小的孔隙排斥, ,经历的路程居中经历的路程居中经历的路程居中经历的路程居中. .– –大分子大分子大分子大分子: :完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外, ,经历的路程最短经历的路程最短经历的路程最短经历的路程最短. .22 •所以洗脱次序仅是分子大小所以洗脱次序仅是分子大小所以洗脱次序仅是分子大小所以洗脱次序仅是分子大小( (分子量分子量分子量分子量) )的函数•分子大小受分子量分子大小受分子量分子大小受分子量分子大小受分子量, ,分子几何形状（环球形、分子几何形状（环球形、分子几何形状（环球形、分子几何形状（环球形、螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组螺旋形或棒形）组分分子间的缔合程度、组分与流动相分子间的缔合程度有关分与流动相分子间的缔合程度有关分与流动相分子间的缔合程度有关分与流动相分子间的缔合程度有关。
23 Size Exclusion Chromatography24 2 2、分配系数和保留值、分配系数和保留值、分配系数和保留值、分配系数和保留值– –(1) (1) 分配系数分配系数分配系数分配系数K K• •组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内组分进入柱子，从高浓度的流动相中向固定相孔隙内扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时扩散，扩散平衡时• •a a、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在、小分子平衡时，一半组分在孔隙内，一半组分在孔隙外 C CS S=C=Cmm K=1 K=1 • •b b、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥、大分子（直径大于固定相孔径时），被全部排斥在固定相孔隙之外在固定相孔隙之外在固定相孔隙之外在固定相孔隙之外 C CS S=0 K=0=0 K=0• •c c、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间，、中等大小分子，直径介于以上两种极限之间， 0
26 二、凝胶类型二、凝胶类型 （自学）（自学）1 1、葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶2 2、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶3 3、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶4 4、多孔玻璃凝胶、多孔玻璃凝胶、多孔玻璃凝胶、多孔玻璃凝胶 1 1～～～～4 4 用于亲水性样品的分离用于亲水性样品的分离用于亲水性样品的分离用于亲水性样品的分离5 5、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品、聚苯乙烯凝胶（非水溶液样品——亲脂性）亲脂性）亲脂性）亲脂性）27 三、实验条件的选择三、实验条件的选择– –分子量较正曲线分子量较正曲线分子量较正曲线分子量较正曲线• •将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物将分子量不同的组分混合物注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别注入柱子，经分离后，分别测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分测得它们的保留体积，以分子量对保留体积作图，得一子量对保留体积作图，得一子量对保留体积作图，得一子量对保留体积作图，得一曲线，称分子量校正曲线。
曲线，称分子量校正曲线曲线，称分子量校正曲线曲线，称分子量校正曲线• •图中，图中，图中，图中，A A、、、、B B两点反映了该固两点反映了该固两点反映了该固两点反映了该固定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量定相能够分离的组分分子量的上限的上限的上限的上限( (排斥极限排斥极限排斥极限排斥极限) )、下限、下限、下限、下限( (全全全全渗透极限渗透极限渗透极限渗透极限) )，只有分子量在，只有分子量在，只有分子量在，只有分子量在A A、、、、B B对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被对应量之间的组分才能被分离1 1、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）、凝胶的选择（主要通过选择凝胶来改善分离）28 2 2、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀、凝胶的溶胀– –干凝胶干凝胶干凝胶干凝胶+10+10倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；倍吸水量的洗脱剂中，缓慢搅拌；– –注意：时间足够长，不易过稀。
注意：时间足够长，不易过稀注意：时间足够长，不易过稀注意：时间足够长，不易过稀3 3、装柱：不应有气泡装柱：不应有气泡装柱：不应有气泡装柱：不应有气泡– –柱长柱长柱长柱长<100cm<100cm4 4、样品的制备、样品的制备、样品的制备、样品的制备– –组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的组别分离（粗分）：上样量可以是柱体积的2525～～～～30%30%– –K K值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的值相近的物质（细分）：上样量可以是柱体积的2 2～～～～5 5％5 5、洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同洗脱：洗脱剂应与溶胀凝胶的溶剂相同– –洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同洗脱剂：水、不同离子强度的溶液、不同pHpH的缓冲的缓冲的缓冲的缓冲液、水液、水液、水液、水－－－－有机溶剂混合液。
有机溶剂混合液有机溶剂混合液有机溶剂混合液6 6、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如、应用：测定大分子物质的分子量（如PrPr）））） 29 。