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1、3.23.2月季的花药培养月季的花药培养1 1、被子植物定义：、被子植物定义：凡是种子有果皮包被着，凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物。胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物。一、被子植物和裸子植物一、被子植物和裸子植物2 2、裸子植物定义：、裸子植物定义：凡是胚珠裸露，外面没有凡是胚珠裸露，外面没有子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为裸子植物。为裸子植物。实例：玉米、大豆、梨、杏实例：玉米、大豆、梨、杏实例：松、杉、柏实例：松、杉、柏花的结构：花的结构：花梗、花梗、花托、萼片、花瓣、雌蕊花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊和
2、雄蕊3 3、花的结构、花的结构二、二、被子植物花粉粒的形成被子植物花粉粒的形成花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉粒囊状结构，内有很多花粉粒1 1、雄蕊的结构、雄蕊的结构雄蕊雄蕊：花粉花粉是是花粉母细胞花粉母细胞经过经过减数分裂减数分裂而形成的，因而形成的，因此，花粉是此，花粉是单倍体单倍体的的生殖细胞。生殖细胞。2 2、被子植物花粉的发育、被子植物花粉的发育花粉粒的形成花粉粒的形成花粉母细胞花粉母细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）减数分裂减数分裂经历时期：经历时期：四分体时期、单核期、双核期四分体时期、单核期、双核期四分体时期四分体时期（进入单核期）（进入单核期）有丝有丝分裂分裂单核
3、靠边期单核靠边期( (小孢子小孢子) )单核居中期单核居中期( (小孢子小孢子) ) 小孢子小孢子（单核花粉粒）（单核花粉粒）精子精子精子精子有丝有丝有丝有丝分裂分裂分裂分裂花粉管细胞核花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞核生殖细胞生殖细胞营养细胞营养细胞双核期双核期两个精子和一个营养核的基因型相同两个精子和一个营养核的基因型相同1 1个个花花粉母粉母细胞细胞4 4个个小小孢子孢子减数减数分裂分裂有丝有丝分裂分裂4 4个花粉管细胞核个花粉管细胞核4 4个生殖细胞核个生殖细胞核有丝有丝分裂分裂8 8个精子个精子2nnnnn四、产生花粉植株的两条途径四、产生花粉植株的两条途径五、影响花药培养的因素五、影
4、响花药培养的因素1 1、材料的选择、材料的选择没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。类及其浓度配比。不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。直接影响。选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一
5、个时期对离体刺激敏感。有某一个时期对离体刺激敏感。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材选材一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期单核靠边期。选择单核期以前的花药接种，选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易质地幼嫩，极易破碎破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核材料的消毒带来
6、困难，且难以挑选到单核期的花药期的花药。花药培养时期的选择花药培养时期的选择其它其它时期选择的缺点时期选择的缺点为了挑选到单核期的花药，为了挑选到单核期的花药，通通常选择完全未开放的花蕾。常选择完全未开放的花蕾。盛盛开的或略微开放的花，都不宜开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。选作实验材料。选择完全未开放花蕾的选择完全未开放花蕾的原因原因 完全未开放的花蕾，可挑完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、选到单核期的花药，菌少、易消毒易消毒单核期花药的挑选单核期花药的挑选为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？ 花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，花瓣
7、松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。给材料的消毒带来困难。 花药培养时间花药培养时间一般月季的花药培养时间选在一般月季的花药培养时间选在5 5月初到月初到5 5月的中月的中旬，即旬，即月季的初花期月季的初花期。初花期的花蕾营养状态。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。率。月季花药培养时的花粉粒最好是（月季花药培养时的花粉粒最好是（ ） A A、四分体时期、四分体时期 B B、单核居中期、单核居中期 C C、单核靠边期、单核靠边期 D D、二核或三核花粉粒、二核或三核花粉粒C C2 2、培养基：、培养基：花药培
8、养基所采用的培养基可能因植物的不同花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同而有所变化而有所变化小麦为小麦为N6N6培养基培养基，马铃薯、月季为，马铃薯、月季为MSMS培养基培养基，油菜为，油菜为B5B5培养基。培养基。3 3、其他因素、其他因素亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响接种的密度等对诱导成功都有一定的影响六、实验操作六、实验操作（一）材料的选取（一）材料的选取某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙焙花青花青- -铬矾法，铬矾法，这种方法能将这种方法能将花粉细胞核染成花粉
9、细胞核染成蓝黑色。蓝黑色。最常用的方法有最常用的方法有醋酸洋红法醋酸洋红法1 1、方法、方法醋酸洋红法染色机理醋酸洋红法染色机理醋酸洋红为醋酸洋红为碱性染色剂碱性染色剂，而花粉细胞内有染色，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是体，染色体主要成分是DNADNA和蛋白质和蛋白质, ,易被碱性易被碱性染料着色染料着色染成红色染成红色 。将体积分数将体积分数4545的醋酸的醋酸100ml100ml煮沸，缓缓加入煮沸，缓缓加入1g1g洋红，再加热回流洋红，再加热回流8h8h，冷却至，冷却至5050，过滤即，过滤即可。可。醋酸洋红的配置醋酸洋红的配置2 2、醋酸洋红法、醋酸洋红法将花药放在载玻片上，加一
10、滴质量分数将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1 1的醋的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。微镜下检查。染色操作染色操作3 3、焙花青、焙花青铬钒法铬钒法将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积比为3 3：1 1的比例的比例混匀混匀卡诺氏固定液的配制方法卡诺氏固定液的配制方法花药应该在花药应该在卡诺氏固定液中卡诺氏固定液中固定固定20min20min，然后取，然后取出放在载玻片上，出放在载玻片上，加焙花青加焙花青铬钒溶液染色，铬钒溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。这种方法能将盖上盖玻片后在显微镜下检查。这种方法能将花粉细
11、胞核染成花粉细胞核染成蓝黑色蓝黑色。将将5g5g铬明矾铬明矾KK2 2SOSO4 4CrCr2 2(SO(SO4 4)24H)24H2 2OO加入加入90ml90ml蒸蒸馏水中，溶解后加入馏水中，溶解后加入0.1g0.1g焙花青，混匀并加热焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸至沸腾，煮沸5 5分钟后冷却至室温，过滤，加蒸分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至馏水定容至100ml100ml。焙花青焙花青铬钒溶液的配制方法铬钒溶液的配制方法染色操作染色操作（二）材料的消毒（二）材料的消毒1 1、酒精处理、酒精处理花蕾用体积分数花蕾用体积分数为为70%70%的酒精的酒精浸泡浸泡3030秒，秒，立即取出。立
12、即取出。无菌水清洗无菌水清洗无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分2 2、消毒液处理、消毒液处理 放入放入质量分数为质量分数为0.1%0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中2-42-4分钟分钟（也可质量分数（也可质量分数为为1%1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液粉溶液）。）。 无菌水冲洗无菌水冲洗3-53-5次次用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。在无菌
13、条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药要彻底去除花丝，要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。不利于愈伤组织或胚状体的形成。立即将花药接种于培养基上，通常每瓶立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花接种花药药7-107-10个个。1 1、剥取花药、剥取花药勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。生愈伤组织。2 2、接种、接种注意：注意：（三）接种和培养（三）接种和培养培养条件：温度控制在培养条件：温度控制在2525左右，不需要左右，不需要光照。光照。幼小植株形成后才
14、需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 3 3、培养、培养培养：一般经过培养：一般经过20-3020-30天培养后，会发现花药天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。基上，以便进一步分化出再生植株。注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培分别移植到新的培养基
15、上，否则这些植株将很难分开。养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是色体倍性的变化（主要原因是营养营养细胞核和生殖细胞核融合细胞核和生殖细胞核融合造成的）。造成的）。4 4、鉴定和筛选、鉴定和筛选5 5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点：、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点：植物组织培养技术与花药培养技术的植物组织培养技术与花药培养技术的相同相同之处是之处是：培养基配制方法、无菌技术及接：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。种操作等基本相
16、同。两者的不同之处在于两者的不同之处在于：花药培养的选材非：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。度大为增加。练习练习1.答：答：F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或或AAsusu。如果运用常规育种方法，。如果运用常规育种方法，将将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米代中的紫色甜玉米
17、与白色甜玉米（aasusu）进行测交）进行测交，可以选择出基因型为，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药培养的技术，在种时间。如果利用花药培养的技术，在F1代代产生的花粉中就可能有产生的花粉中就可能有Asu的组合，再将花粉的组合，再将花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（甜玉米的纯合体（AAsusu）。）。这种方法可以这种方法可以大大缩短育种周期。大大缩短育种周期。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！27
