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1、以釉原蛋白基因进行性别鉴定实验九以釉原蛋白基因进行性别鉴定实验目的与要求：实验目的与要求：通过此实验学会PCR检测技术，包括DNA提取、分光光度计的使用、引物设计的原则、PCR扩增的条件设定，以及电泳和测序结果分析等。实验原理：实验原理：针对Amelogenin基因内含子1区X染色体上6bp缺失的特性，采用一对X、Y同源引物扩增，男性个体同时得到X染色体Amelogenin等位基因特异性段(简称Am X，106bp或212bp)和Y染色体Amelogenin等位基因特异性片段(简称Am Y，112bp或218bp)，分型结果表现出两条谱带；而女性仅有Am X(106bp或212bp)，分型表现
2、为一条谱带，因此鉴定性别。实验内容：实验内容：样品采集DNA提取和含量检测PCR扩增凝胶电泳测序结果分析第三节口腔疾病分子生物学实验设备及器材：实验设备及器材：5ml无菌试管（含肝素抗凝剂）；PowerPlex M16 system DNA提取试剂盒，Am 基因上游引物和下游引物，2Taq PCR MasterMix；20bp DNA Ladder Marker；DNA片段快速纯化试剂盒。PCR仪，凝胶成像仪，微量紫外分光光度计，电泳仪 。实验方法：实验方法：样品采集采集静脉血5ml于无菌抗凝管中DNA 提取和含量检测性别鉴定PCR 扩增、凝胶电泳、纯化测序第三节口腔疾病分子生物学PCR的基本
3、原理的基本原理试管中管中进行的行的DNA复制反复制反应，依据，依据DNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变性性和复性和复性的性的性质；通通过人人为控控制制体体外外合合成成系系统的的温温度度，使使双双链DNA变成成单链，单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，DNA聚聚合合酶使使引引物物沿沿着着单链模模板板延延伸伸为双双链DNA。PCR反反应体系体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR的条件的条件设定定
4、7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的条件的条件设定定1.变性：高温使双链变性：高温使双链DNA解离形成单解离形成单链（链（94，30s）。）。2.退火：低温下，引物与模板退火：低温下，引物与模板DNA互互补区结合（补区结合（55，30s）。）。3.延伸：中温延伸。延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化聚合酶催化以引物为起始点的以引物为起始点的DNA链延伸反应链延伸反应（7072，3060s）紫外分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计，就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光
5、能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。凝胶电泳凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置在电场当中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。迁移率不同，其最终分布于不同条带。实验方法：实验方法：DNA 提取和含量检测提取和含量检测：抗凝全血2ml+ 8m冷l蒸馏水混匀后离心弃上清加等体积预冷0.1% T
6、riton-X 100离心，弃上清 加2ml裂解液打碎沉淀 加10% SDS 100l 混匀加10mg/ml蛋白酶K 40l混匀，55 3小时加入6.0mol/L NaCl 0.7ml震荡20秒离心40分钟取上清加2倍体积的无水乙醇混匀呈絮状DNA沉淀挑取沉淀加80%乙醇洗涤沉淀2次加50l TE 溶解DNA 加入200l 5% Chelex-100，2l( 10mg/mL)蛋白酶K ，震荡10秒摇床150r/min，56恒温孵化12小时，震荡15秒100水浴8分钟，震荡15秒12000r/min 离心5分钟，取上清液紫外分光光度计检测样品在260nm的OD值确定DNA含量第三节口腔疾病分子生
7、物学实验方法：实验方法：性别鉴定性别鉴定PCR 扩增扩增、凝胶电泳、纯化测序、凝胶电泳、纯化测序uPCR 扩增：扩增：PCR反应引物序列如下：上游引物( 5- CCCTGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG-3)，下游引物( 5-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG3)；模板DNA为上述血液所获样品的DNA提取液。PCR 反应体系为25L，其中2Taq PCRMasterMix 12.5l，上下游引物( 1mol /L)各1l，无菌双蒸水9.5l，模板DNA 1l。uPCR 反应参数反应参数: 95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸3
8、0秒，35个循环；72延伸7分钟。u凝胶电泳凝胶电泳：制备浓度为3g/L的琼脂糖凝胶，置1TAE电泳缓冲液中，电泳条件为: 电压100V，电泳时间120分钟。电泳结果放入凝胶成像仪中进行观察。u纯化测序：纯化测序：将琼脂糖凝胶上的特异性条带切下纯化、回收、测序。第三节口腔疾病分子生物学注意事项注意事项：u引物引物 引物是PCR反应的关键，其特异性取决于引物与模板DNA的互补程度。引物的长度最好为15bp30bp；引物扩增跨度以200bp500bp为宜，特定条件下可扩增长度至10kb的片段；其中G+C含量以40%60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物
9、内部出现二级结构或两条引物间互补，特别是3端的互补；3端的碱基，尤其最末及倒数第二个碱基应严格要求配对；引物中有或最好加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点；引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；每条引物的浓度0.1mol1mol或10pmol100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。uPCR 循环次数循环次数 循环次数决定PCR扩增的程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30次40次之间，循环次数越多，但非特异性产物的量亦随之增多。u设立对照设立对照 PCR反应应设立阳性对照和阴性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否
10、合乎理论要求的一个重要参考指标。第三节口腔疾病分子生物学结果分析：结果分析：M-marker；1、2-阴性对照；3、5-女性；4-男性 第三节口腔疾病分子生物学为什么要用冷蒸馏水，冰中放置5分钟后，在4下离心？提取过程中细胞壁破碎细胞质流出，中间有酶会降解流出的DNA，因此要低温保存来抑制酶的活性，防止DNA被降解。Triton X-100n100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂），它能溶解脂质，提高真核细胞细胞膜的通透性。其中1%的TritonX-100常用于漂洗组织标本和破坏细胞。SDS十二烷基硫酸钠SDS是一种能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙
11、烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。在尿素或SDS中，蛋白酶K显示更高的酶活性。蛋白酶K的最佳反应温度为65，但在65或更高的温度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多时候反应温度选择50-55。6.0mol/Nacl的作用的作用DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。为什么用无水乙醇沉淀为什么用无水乙醇沉淀DNA？
12、n用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。nDNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。TE溶液溶液TE是由Tris（三羟甲基氨基甲烷）和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。Chelex-100Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高
13、价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，能有效除去非核酸有机物。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA分离。紫外分光光度计测试样品在紫外分光光度计测试样品在260nm的的OD值值光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度.通过DNA的OD260（260nm下的吸光值）可以知道DNA的浓度具体换算是DNA浓度（ug/ml）=OD260*50*稀释倍
14、数OD260计量核酸OD280计量蛋白OD230计量盐离子OD320计量背景2Taq PCR Mastermix做PCR时的预混液，将除了模板、引物以外其他的组分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用时直接加入模板和引物就可以，这样做节省时间，也不用考虑反应体系性能问题。一般包括缓冲液、镁离子、酶和dNTP。PCR的基本步骤的基本步骤1234522557294时间（min）温度（）低温退火2高温变性1适温延伸3重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍凝胶电泳在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态,从这种意义上讲,DNA和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子(Polyanions)。因此,当核酸分子被放置在电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
