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1、菌种的管理和保藏菌种的来源菌种的来源国内或国外认可的菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。2024/8/202024/8/202 2-广泛收集各种有用的微生物菌种。-选择最适宜的保藏方法。菌种保藏的中心任务菌种保藏的中心任务2024/8/202024/8/203 3常用菌种保藏方法常用菌种保藏方法 菌种保藏的原则菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性根据微生物菌种的生理、生化特性 降低微生物细胞的代谢强度。降低微生物细胞的代谢强度。 2024/8/202024/8/204 4 标标准准菌菌株株的的复复活活或或培培养养物物的的制制备备应应按按供供应应商
2、商提提供供的的说说明明或按验证的方法进行。或按验证的方法进行。 标标准准储储备备菌菌株株- -从从国国内内、外外菌菌种种收收藏藏机机构构获获得得的的标标准准菌菌株株经复活并在适宜的培养基中生长后经复活并在适宜的培养基中生长后, ,既为标准储备菌株。既为标准储备菌株。菌种的保藏菌种的保藏2024/8/202024/8/205 5菌种的保藏菌种的保藏 抑制微生物的代谢和生长繁殖，抑制微生物的代谢和生长繁殖， 如低温、干燥和真空等如低温、干燥和真空等 标准储备菌株经纯度和特性确认后，分装于小瓶中标准储备菌株经纯度和特性确认后，分装于小瓶中, , 可采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻可采用低温冷冻
3、干燥，液氮储存，超低温冷冻( (低低 于于-70)-70)等方法保存。等方法保存。 2024/8/202024/8/206 6菌种的保藏菌种的保藏低于-70-70或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间. . 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作工作 菌株菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后, ,不得重新冷冻不得重新冷冻 或再次使用。或再次使用。2024/8/202024/8/207 7菌种的保藏菌种的保藏工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。2
4、024/8/202024/8/208 8菌种的保藏菌种的保藏 不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的 保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：2024/8/202024/8/209 9 挑选特征典型的纯菌菌落。挑选特征典型的纯菌菌落。 确确定定保保藏藏的的合合适适菌菌体体形形态态，孢孢子子和和芽芽孢孢死死亡亡代代谢谢作作用用弱弱，同同时时对对恶恶劣劣环环境境 有很强的抵抗力。有很强的抵抗力。 选择最适宜的方法。选择最适宜的方法。 定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保藏方法的有效
5、性。藏方法的有效性。菌种的保藏菌种的保藏2024/8/202024/8/201010方法方法方法方法主要原理主要原理主要原理主要原理 适用的微生物适用的微生物适用的微生物适用的微生物保藏时间保藏时间保藏时间保藏时间 特点特点特点特点 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 超低温超低温广泛广泛数十年数十年复杂、需要专门设备，有效复杂、需要专门设备，有效冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法 干燥、缺氧、低温干燥、缺氧、低温 广泛广泛5 51010年以上年以上复杂、需要专门设备和方法，有效复杂、需要专门设备和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无营养干燥、无营养 产孢微生物
6、产孢微生物1 11010年年较简便，需制备沙土管，有效较简便，需制备沙土管，有效液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法低温、缺氧低温、缺氧广泛广泛1 1年以上年以上简便简便琼脂斜面低温保藏法琼脂斜面低温保藏法 低温低温 4 4 广泛广泛短时间短时间简便简便液体冷液体冷冻保藏冻保藏法法 液体培养基液体培养基 低温低温 广泛广泛半年以上半年以上简便简便一定比例甘油一定比例甘油 低温、缺氧低温、缺氧 广泛广泛数十年以上数十年以上简便简便瓷珠冷冻保藏法瓷珠冷冻保藏法 低温低温 广泛广泛1 1年以上年以上简便简便菌种的保藏菌种的保藏2024/8/202024/8/201111琼脂斜面低温保藏法 菌种菌种培养基培养
7、基保存温度保存温度传接时间传接时间细菌细菌一般为营养琼脂斜面培养基，或根据一般为营养琼脂斜面培养基，或根据菌种规定选用培养基菌种规定选用培养基4 466芽孢菌芽孢菌3 36 6个月，其他个月，其他细菌约细菌约1 1个月个月酵母菌酵母菌霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂斜面培养基斜面培养基4 466一般一般3 36 6个月个月真菌真菌PDAPDA琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基4 466一般一般3 36 6个月个月2024/8/202024/8/201212液体冷冻保藏法液体冷冻保藏法菌种菌种菌种菌种保存液（保存液（保存液（保存液（2mL2m
8、L2mL2mL）保存温度保存温度保存温度保存温度 保存时间保存时间保存时间保存时间 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌营养肉汤营养肉汤营养肉汤营养肉汤1%1%蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨甘油甘油甘油甘油水水水水 10%10%10%10%40%40%40%40%甘油甘油甘油甘油-30-30-30-30 -80-80-80-80 半年以上半年以上半年以上半年以上或数十年或数十年或数十年或数十年 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌胆盐乳糖增菌液胆盐乳糖增菌液胆盐乳糖增菌液胆盐乳糖增菌液乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙
9、门菌乙型副伤寒沙门菌铜绿假单孢杆菌铜绿假单孢杆菌铜绿假单孢杆菌铜绿假单孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌疱肉培养基疱肉培养基疱肉培养基疱肉培养基白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌 改良马丁培养改良马丁培养改良马丁培养改良马丁培养基基基基黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉2024/8/202024/8/201313液体冷冻保藏法 制备方法制备方法1%1%蛋白胨蛋白胨1.5ml1.5ml加入加入甘油甘油0.15ml0.15ml , ,接种接种新鲜培养物,培养.保存条件-80可保存数年. 2024/8/202024/8/201414瓷珠菌种保存瓷珠菌种保存使用方法-用接种环挑取18-24小时新鲜培养
10、物接入冻存液中-拧紧瓶盖，来回颠倒制成均匀的菌悬液-使菌悬液充分吸附在小瓷珠内外表面-将冻存管中的菌悬液吸出-使用时充分摇匀使管内瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板培养基上划线接种或接种液体培养基,培养。保存条件室温保存12个月、-20保存12个月、-80可保存24个月2024/8/202024/8/201515二、菌种的传代和使用工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。2024/8/202024/8/201616 细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物、含有微生物或可能污染有微生物的样品接种到培养基上的一种操作技术
11、。2024/8/202024/8/201717常用培养基种类常用培养基种类 斜面培养基 半固体斜面培养基 液体斜面培养基 平板斜面培养基2024/8/202024/8/201818接种方法接种方法涂布法涂布法划线法划线法穿刺法穿刺法直接加入法等直接加入法等2024/8/202024/8/201919 分离分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成 单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的 操技术。操技术。 分离一般采用平板培养基。分离一般采用平板培养基。 分离方法主要有分段划线法、连续划线法、分离方法主要有分
12、段划线法、连续划线法、 涂布分离法、倾注分离法等。涂布分离法、倾注分离法等。2024/8/202024/8/202020 接接种种后后的的培培养养基基，根根据据不不同同微微生生物物生生长长条条件件的的要要求求，培培养养基基放放在在适适宜宜微微生生物物生生长长的的环环境境中中温温度度、湿湿度度、氧氧气气等等），使使其其生生长长繁殖的过程。繁殖的过程。 需气菌培养法需气菌培养法 厌氧培养法厌氧培养法培养2024/8/202024/8/202121培养后微生物的生长判断培养后微生物的生长判断固体培养基固体培养基有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。液体培养基液体培养基浑浊、菌膜
13、、沉淀等。浑浊、菌膜、沉淀等。2024/8/202024/8/202222菌种的传代和使用 冻干菌种（冻干菌种（0 0代）代） 增菌液培养（增菌液培养（1 1代）代） 增菌液培养（增菌液培养（2 2代）代） 分装冷冻保存分装冷冻保存 增菌液培养增菌液培养 适宜的斜面培养基适宜的斜面培养基 使用使用 工作菌株（工作菌株（3 3代）代） 工作菌株传代（工作菌株传代（4 4代）代） 冷冻保存冷冻保存 工作菌株传代（工作菌株传代（5 5代）代） 冷冻保存冷冻保存 如如使使用用蛋蛋白白胨胨、甘甘油油水水，可可取取各各代代的的斜斜面面培培养养物物，加加入入培培养养基基中中，在在规规定条件培养后冷冻保存。定
14、条件培养后冷冻保存。2024/8/202024/8/202323斜面培养物 稀释（比浊或预实验） 菌液稀释 平 板 计数 验证实验、阳性对照 平板计数也可和试验同时进行菌液的制备和使用2024/8/202024/8/202424 三、菌种的检查与复壮 菌种的衰退菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用 而引起某些优良特性变弱或消失的现象。而引起某些优良特性变弱或消失的现象。控制菌种的衰退方法控制菌种的衰退方法 控制传代次数控制传代次数 创造适宜的培养条件创造适宜的培养条件 采用有效的保藏方法采用有效的保藏方法2024/8/20
15、2024/8/202525 定期检查定期检查 定定期期检检查查 复复活活、分分离离、纯纯化化、检检查查鉴鉴定定和和再再保保藏藏。发发现现变变异异或衰退，应及时给予恢复。或衰退，应及时给予恢复。 主要检查项目主要检查项目 菌菌落落形形态态、革革兰兰染染色色、显显微微镜镜下下菌菌体体形形态态、生生化化特特性性及及血血清清学学检检查。查。 菌种的检查与复壮2024/8/202024/8/202626菌种的复壮菌种的复壮 主要采用分离纯化的方法。经过形态特征、生理生化特主要采用分离纯化的方法。经过形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定，证明复壮征、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定，证
16、明复壮后的菌种与原种完全一致，方可认为菌种已被复壮。后的菌种与原种完全一致，方可认为菌种已被复壮。菌种的检查与复壮2024/8/202024/8/202727四、菌种的管理四、菌种的管理 使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知 识和技术水平，并应具有较强的责任心。识和技术水平，并应具有较强的责任心。 2024/8/202024/8/202828菌种的管理菌种的管理 实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称
17、、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。2024/8/202024/8/202929菌菌种种应应冷冷藏藏或或冷冷冻冻保保存存，保保存存菌菌种种的的冰冰箱箱不不得得放放置置食食品品和和易易挥挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。由由专专人人按按操操作作规规程程和和有有关关要要求求定定期期进进行行传传代代，并并定定期期对对保保存存的的菌菌种种进进行行检检查查，一
18、一般般每每年年1 12 2次次，（或或定定期期更更换换冻冻干干菌菌种种）。发发现现菌菌种种的的异异常常情情况况应应及及时时检检查查。一一旦旦发发现现菌菌种种污污染染和和变变异异现现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。 菌种的管理菌种的管理2024/8/202024/8/203030详细记录详细记录菌菌种种的的来来源源、接接收收、传传代代、分分离离、复复壮壮、使使用用和和鉴鉴定定等等均均应应做做好好详详细细记记录录。包包括括菌菌保保存存位位置置、环环境境( (温温度度) )、种种传传代代或或使使用用时时间间、名名称称、菌菌号号、代代数数、传传代代或
19、或保保存存形形式式、分分离离、复复壮壮方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。2024/8/202024/8/203131菌菌种种不不得得随随意意带带出出实实验验室室，外外单单位位索索取取、购购买买应应有有证证明和登记，并包装严密。明和登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录记录。 2024/8/202024/8/203232菌悬液的制备与保存菌悬液的制备与保存采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验用菌悬液的制备如下：1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌
20、、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时.2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。2024/8/202024/8/2033333、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天。加入35ml含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。2024/8/202024/8/2034344、菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。2024/8/202024/8/2035352024/8/202024/8/203636此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
