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1、实验实验 十十 PEGPEG法诱导鸡血细胞融合法诱导鸡血细胞融合College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity一、实验目的一、实验目的n了了解聚乙二醇（解聚乙二醇（PEGPEG）诱导体外细胞融合诱导体外细胞融合的基本原理。的基本原理。n通过通过PEGPEG诱导鸡血细胞之间的融合实验诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。初步掌握细胞融合的基本方法。二、实验原理二、实验原理n细胞融合（细胞融合（cell fusioncell fusion）又称又称体细胞杂交体细胞杂交，是指用，是指用人工方法使两个或两个以上的
2、体细胞融合成异核体人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（个细胞核的杂种细胞（hybrid cellhybrid cell）。）。n细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂助融剂的不同，细胞融合可分为：的不同，细胞融合可分为：病毒诱导的细胞病毒诱导的细胞
3、融合，如仙台病毒融合，如仙台病毒( (hemagglutinatinghemagglutinating virus of virus of Japan,HVJJapan,HVJ););化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycolpolyethyleneglycol ,PEG ,PEG）; ;电场诱导的细胞融电场诱导的细胞融合；激光诱导的细胞融合。合；激光诱导的细胞融合。 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞 接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于接触点处质膜的脂类分子发生疏散和
4、重组，由于 两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此 的表面张力作用，使细胞发生融合。的表面张力作用，使细胞发生融合。 细胞融合的频率和活力与所用细胞融合的频率和活力与所用PEGPEG分子质量、浓度、分子质量、浓度、 作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。 骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合骨髓间质充质干细胞移植后的细胞融合荧光标记的细胞融合荧光标记的细胞融合三实验仪器、材料和试剂三实验仪器、材料和试剂n仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微机
5、、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。酒精灯等。n材料：成年家鸡。材料：成年家鸡。（1）0.85%NaCl溶液溶液:（2）GKN液：液：8.0gNaCl，0.4gKCl,1.77gNa2HPO42H2O，0.69gNaH2PO4H2O，2.0g葡萄糖，葡萄糖，0.01g酚红，溶于酚红，溶于1000ml重蒸水中。重蒸水中。（3）50%（m/v）PEG溶液：溶液：取取50gPEG(相对分子量相对分子量=4000)放放入入100ml瓶中，高压灭菌瓶中，高压灭菌20min。让。让PEG冷却至冷却至50-60，勿让其凝固。
6、加入勿让其凝固。加入50ml预热至预热至50的的GKN液，混匀，置液，混匀，置37备用。备用。（4）Hanks原液原液(10)：NaCl80.0g；Na2HPO412H2O1.2g；KCl4.0g；KH2PO40.6g；MgSO47H2O2.0g；葡萄糖葡萄糖10.0g；CaCl21.4g。 试剂试剂 称取称取1.4g1.4g的的CaCl2CaCl2，融于，融于30-50ml30-50ml的重蒸水中。取的重蒸水中。取1000ml1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml800ml于烧于烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前杯中，然后按上述
7、配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的全溶解后，再将已溶解的CaClCaCl2 2溶液加入，最后加水至溶液加入，最后加水至1000ml1000ml。（6 6）HanksHanks液：液：HanksHanks原液原液100 ml100 ml，加重蒸水，加重蒸水896 ml896 ml， 加加0.5%0.5%酚红酚红 4 ml4 ml。配好的。配好的HanksHanks液，分装包扎好液，分装包扎好 贴上标签，经过灭菌后，贴上标签，经过灭菌后，44保存。保存。（7 7）詹纳斯绿染液。）詹纳
8、斯绿染液。（一）鸡血细胞的体外融合（一）鸡血细胞的体外融合1.1.鸡血细胞的获得鸡血细胞的获得 用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，用肝素溶液润洗注射器，从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，速加入肝素（注入试管后，速加入肝素（100U100U肝素肝素/5ml/5ml全血）混合，制成全血）混合，制成抗凝全血。抗凝全血。2.2.鸡血细胞储备液的制备鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入在抗凝全血的试管中，加入4 4倍体积的倍体积的0.85%NaCl0.85%NaCl溶液，制溶液，制成红细胞储备液，置于成红细胞储备液，置于44冰箱内可供一周内使用。冰箱内可供一周内使用。
9、3 3、鸡血细胞悬液的制备、鸡血细胞悬液的制备 取细胞悬液取细胞悬液1mL1mL，加，加4mL0.85%NaCl4mL0.85%NaCl溶液混匀，溶液混匀，1200r/min1200r/min离离心心5min5min，弃上清液，再加入，弃上清液，再加入5ml 0.85%NaCl5ml 0.85%NaCl溶液按上述条件溶液按上述条件离心两次（离心两次（5 5分钟，分钟，1010分钟分钟）。）。最后，弃去上清液，加入最后，弃去上清液，加入10ml10ml的的GKNGKN溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取溶液，制成鸡血细胞悬液。吸取0.5ml0.5ml鸡血细胞悬液，鸡血细胞悬液，加入加入4.5ml4.5m
10、l的的GKNGKN液进行稀释。液进行稀释。四、方法与步骤四、方法与步骤 吸吸取悬液取悬液1mL放入离心管中，加入放入离心管中，加入4mLHanks液混匀，液混匀，1000r/min离心离心5min，弃上清液，再加入适量，弃上清液，再加入适量GKN液，使成液，使成10%的悬液。的悬液。4、PEG诱导细胞融合诱导细胞融合吸取吸取0.5ml37的的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在与细胞混匀，然后在37水浴中静置水浴中静置5-10min。5、染色和镜检、染色和镜检 吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一
11、滴，加入詹纳斯绿染液吸取细胞悬液，在凹面玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色混匀，染色5min后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞后盖上盖玻片，在显微镜下进行观察细胞融合情况。融合情况。 观察时注意不同程度的观察时注意不同程度的融合现象融合现象。通常分为五。通常分为五个阶段。个阶段。两细胞膜接触，粘连；两细胞膜接触，粘连；细胞膜形成穿细胞膜形成穿孔；孔；两细胞的细胞质连通；两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞通道扩大，两细胞连成一体；连成一体；细胞完全合并，形成一个含有两个或细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。多个核的圆形细胞。6 6计算细胞融合率计算细胞融合率 细胞融合率是
12、指在显微镜的视野内，已发生融合细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。准确。 细胞融合过程在形态上的变化细胞融合过程在形态上的变化 五、实验结果五、实验结果六、注意事项六、注意事项1.1.高压灭菌过的高压灭菌过的PEG PEG 冷却至冷却至50-6050-60时就加入时就加入预热至预热至5050的的GKN GKN 液，勿让
13、其凝固。液，勿让其凝固。2.2.严格控制严格控制PEGPEG的作用时间，通常处理细胞的作用时间，通常处理细胞1 12min2min。3.3.终止终止PEGPEG的作用时，缓慢加入的作用时，缓慢加入5ml Hanks 5ml Hanks 液，液，轻轻吹打，以免融合的细胞分离或破裂。轻轻吹打，以免融合的细胞分离或破裂。1 1绘出典型的细胞融合过程图。绘出典型的细胞融合过程图。2 2计算细胞融合频率。计算细胞融合频率。3 3说明影响原生质体融合的因素说明影响原生质体融合的因素。七、作业七、作业本实验所用本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合，因
14、为植物细胞具有细胞壁，合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合；无法介导其细胞融合；但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合融合方法进行融合实验。方法进行融合实验。影响原生质体融合的因素。影响原生质体融合的因素。（1）首先是酶解条件：）首先是酶解条件：渗透压稳定剂渗透压稳定剂Ca2+、Mg2+、蔗糖、蔗糖可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生可保持原生质体稳定利于再生；随着酶解时间的增加原生质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体质体的释放量增大；酶解浓度到达一定浓度后，原生质体的再生率下降；再就是酶解温度。的再生率下降；再就是酶解温度。（2）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质）原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合体会很快再生细胞壁，因此在洗去酶液后，应立即进行融合处理。处理。（3）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质）原生质体的悬浮状况也会影响融合，如果两亲本原生质体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应体密度相差较大，就难以混和均匀，接触机会减少，这时应用离心方法强迫它们密集用离心方法强迫它们密集
