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1、人类疾病动物模型广东省实验动物监测所1人类疾病动物模型定义n人类疾病的动物模型（Animal Model of Human Disease）是指在生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和材料。n动物模型是一只只动物的集合。n应用：疾病机理研究；药效评价等。 2人类疾病动物模型n疾病动物模型是从整体上进行评价，什么是整体的正常或健康状态？n疾病动物模型工作的对象是异常的、病态的或反常的，不是正常的或健康的动物。动物模型研究首先要明确动物疾病的论断。n模式动物：经常使用的、确知有用的、已标准化的，用于疾病模型研究的动物。3人类疾病动物模型研究意义n避免人体接受实验的风险；n
2、便于实验材料的获取与比较；n简化实验操作；n提供发病率较低的疾病材料；n有助于更全面地认识某些疾病的性质。4人类疾病动物模型n 以模拟人类疾病表现或机理为目的n 实验动物为载体n 使用特定的方式进行模型研制n 以方便实用有效可控为前提疾病动物模型的特点5人类疾病动物模型n怎么去评价一个动物模型的成功建立？ 相似性 一致性 实用性 可控性 可重复性 易行性 可靠性 经济性6人类疾病动物模型人类疾病动物模型的类型n完全疾病表现的模型，最理想的疾病模型；n部分疾病表现的模型；n同类疾病的模型或参比疾病的模型；n疾病病理的模型；n病原免疫的模型；n基因工程疾病的模型；n复合疾病的模型；n群体动物的模型
3、；n特殊疾病的模型；7人类疾病动物模型疾病动物模型研究、应用规范n动物规范要求，实验动物、经济动物和野生动物。n病原规范化要求，标准株、模式株、代表株。n研究规范要求，接种方式、模型指标等。n模型研制途径要求。n剂量要求，疾病的最大化原则。n模型指标要求，临床研究、疾病病原学要求，免疫学要求，病理生理。n药物疫苗研究规范。8人类疾病动物模型疾病动物模型分类n动物模型分类方式较多，产生原因、系统、病理、中医药体系等。n按产生原因分类：自发性动物模型和诱发性动物模型。 9人类疾病动物模型自发性疾病动物模型n动物自然发生的疾病或由于基因突变的异常表现通过遗传育种定向培育保留下来的动物模型。 10人类
4、疾病动物模型n优点：人为因素少，更接近人类自然发病，应用价值高，广泛应用于遗传性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。n缺点：发现的种类有限，发病的因素复杂，发病的条件要求高，可复制性差，尚不能普遍应用。11人类疾病动物模型nT淋巴细胞功能缺陷的动物 （裸小鼠、裸大鼠）nB淋巴细胞功能异常的动物 （CBA/N小鼠）n严重联合免疫缺陷动物 （SCID小鼠和SCID-hu小鼠）12人类疾病动物模型自发性肿瘤动物模型n C3H 乳腺癌（100%），受多种因素的诱导和调节，包括病毒、化学致癌物、辐射、激素、遗传背景、饲料和免疫状况等。其中病毒是最重要的因素，小鼠肿瘤病毒MMTV/S（Bittner病毒），高度致癌
5、性，主要作用于C3H、DBA等品系小鼠，潜伏期一般1年。n自发性乳腺癌模型应用，选用高发病率的C3H小鼠DBA/2小鼠，获得CD2F1小鼠，出生后10.5月后出现乳腺肿瘤，而后存活20-35天死亡。 13人类疾病动物模型14人类疾病动物模型诱发性疾病动物模型n诱发性动物模型：应用各种物理、化学、生物或复合致病 因素作用于动物后认为诱发动物产生某些类似人类疾病的模型。15人类疾病动物模型n优点：短时间内复制出大量疾病模型，实验条件易控制，重复性好。n缺点：与自然发生的人类疾病在某些方面存在一定差异，存在一定的局限性。16人类疾病动物模型诱发性动物模型制作原则n动物选择原则，实验动物、经济动物、野
6、生动物；n病原选择原则，标准株、模式株、代表株等。n疾病最大化原则，最大程度拟疾病临床表现、疾病过程、病理生理特征、免疫特征等。n标准化、规范化原则，可控性、可重复性。n生物安全原则。17人类疾病动物模型感染性疾病动物模型 流感病毒感染动物模型n小鼠感染模型；n雪貂感染模型；n猴感染模型；n其它模型，猪、兔感染模型。 18人类疾病动物模型品系（ ICR Swiss、Swiss-Webster 和 BALB/c ）性别无差异，常用雌性年龄，刚断奶小鼠易感，适应株5-8周小鼠毒株，鼠适应株 A/ PR/ 8/ 34 ( H1N1) 和A/ FM/ 1/ 47 ( H1N1) 鼻腔接种，气溶胶接种临
7、床症状， 48-96小时出现症状，呼吸频率加快，体温下降肺部实变，肺组织重量 ，动脉血氧饱和度 ，肺组织匀浆中进行病毒检测19人类疾病动物模型最易感动物，病毒不需要适应鼻孔接种临床症状，体温升高、流涕、张口呼吸、活动迟缓病毒滴度测定、病理诊断等20人类疾病动物模型n猴、猿等灵长类动物与人具有相似的生理、生化特征，其作为实验动物有着其它动物不可替代的优势。n但由于动物珍贵，实验成本高及受伦理学方面的限制，很少用于流感的研究。21人类疾病动物模型实验动物品系影响u实验动物实验动物 不同品系小鼠对H5N1禽流感病毒易感性不同。品系ICR小鼠BABL/c小鼠NIH小鼠C57小鼠KM小鼠 死亡率5070
8、%40251022人类疾病动物模型不同品系小鼠感染体温变化23人类疾病动物模型不同品系小鼠感染肺病理变化u肺脏充血和水肿； 器官和支气管内有血性分泌物； 粘膜下层有灶性出血、水肿和细胞浸润； 肺泡腔内含有纤维蛋白和渗出液，呈现浆液性出血性支气管肺炎。正常小鼠BABL/C小鼠ICR小鼠昆明小鼠24人类疾病动物模型不同日龄小鼠易感性u刚离乳至性成熟之前的小鼠比较敏感，死亡率高于其它组的小鼠。 组别体重死亡率刚离乳组11-13g16.7% 离乳至性成熟组14-16g 50% 16-18g 50% 性成熟组18-20g 30% 25人类疾病动物模型病毒株影响uA/Goose/Guangdong/NH/
9、2003(H5N1)，经过对其HA，NA，NP，NS，PA，PB1，PB2，M蛋白的测序分析，该病毒HA、NA分别与2001年、2003年福建分离的猪流感病毒的同源性较高。u经鸡胚尿囊液增殖，鸡胚半数致死量（EID50）为107.31/0.1 mL，鼻腔接种小鼠。u不需要小鼠适应。u禽流感感染小鼠早期典型毒株HK_483_97（小鼠急性死亡，肺外器官感染）, HK_486_97（小鼠不死亡）, HK_156_97（介于两者之间）；我们使用的毒株对小鼠的毒力类似于HK_156_97株。26人类疾病动物模型接种途径u鼻腔接种，禽流感模型常用的接种方法；u静脉接种，能引起死亡，死亡率低于鼻腔接种，肺
10、能形成弥散性肺泡损伤及渗出性炎症，不能检测到病毒载量。u脑内接种，不引起动物死亡，注射部位出现小胶质细胞浸润。静脉腔接种肺部2d病变 脑内接种第3天脑 27人类疾病动物模型模型指标模型指标u临床症状：临床症状：接毒组小鼠出现呼吸急促，饮食量下降，精神不振，弓背、蜷缩、竖毛、颤抖，反应性差，活动减少，爱扎堆。极度衰竭小鼠 潜伏期的小鼠恢复后的小鼠恢复期的小鼠 28人类疾病动物模型uH5N1感染小鼠的死亡分布，感染第2d出现死亡，第3-7d死亡高峰，死亡率达86.7%，ST50在5.25d。 29人类疾病动物模型u病理特征：感染小鼠的临床特征出现早期、进展期和死亡高峰期和恢复期，表现呼吸困难，甚至
11、死亡；组织病理变化显示弥散性肺泡损伤及渗出性炎症。感染第2天，肺泡出血感染第2天，肺间质增生，肺泡隔增宽，肺泡萎缩感染第8天，大量纤维素性及浆液性渗出，有透明膜形成 30人类疾病动物模型小鼠感染H5N1禽流感病毒与人感染的临床特征比较潜伏期临床特征症状与体征病程人一般为1-3天，通常在7天之内发病年龄以儿童和青壮年为主；女性病人略多于男性；病死率高发热；全身中毒症状（肌肉酸痛，寒战，乏力，头痛）；呼吸困难；消化道症状；神经系统表现；多器官功能衰竭。早期（1-4天）、进展期（5-21天）和恢复期（22天后）小鼠0-1天对离乳后，性成熟之前小鼠更易感 体温降低；呼吸困难；活动减少；食欲下降；聚堆，
12、立毛。早期（0-1天）；进展期（2-7天），死亡高峰期（3-5天）；恢复期（8-14天）31人类疾病动物模型脏器病变类别BALB/c小鼠人肺炎症细胞浸润肺泡中大量巨噬细胞和少量中性粒细胞浸润，肺间质和终末细支气管有淋巴细胞浸润，感染晚期，肺组织中有浆细胞产生。肺泡中主要是巨噬细胞，间质中主要是T淋巴细胞，肺中可见散在的具噬红细胞活性的组织细胞，感染晚期偶见浆细胞；充血、出血、水肿间质、肺泡、终末细支气管出血，血管、终末细支气管周结缔组织水肿。肺水肿。增生肺间质增生，肺泡隔轻度增宽，肺泡萎缩。肺泡型细胞增生，早期肺泡隔轻度增宽；中期间质反应性纤维母细胞增生；晚期呈纤维化改变，部分肺泡萎缩或代偿性
13、气肿。渗出肺泡中纤维素性及浆液性渗出，有透明膜形成。肺泡中纤维素性渗出。细胞坏死脱落终末细支气管的上皮肿胀、脱落，脱落的上皮细胞进入肺泡中。上皮细胞脱落，并进入肺泡腔。其他肺泡扩张；胸膜炎；肺泡上皮细胞和白细胞凋亡。小鼠感染H5N1禽流感病毒与人感染病理比较32人类疾病动物模型H5N1病毒感染小鼠体内病毒检测病毒感染小鼠体内病毒检测uRT-PCR检测接毒小鼠（BALB/c）肺病毒在第1天至第九天均能检出，心、肝、脾、肾、脑、胸腺均未能检出。33人类疾病动物模型H5N1病毒感染小鼠组织中的病毒的增殖结果Replication of virus in infected H5N1 mouse tis
14、suesRouteVirus titera（log10 EID50/g）Lung肺Heart心Liver肝Spleen脾Kidney肾Brain脑Intranasal（100 L）2.78a：The tissues were collected on day 3; -: H5N1 virus was not detected。34人类疾病动物模型感染小鼠抗体变化趋势感染小鼠抗体变化趋势35人类疾病动物模型H5N1病毒感染小鼠的病毒感染小鼠的T T淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化u血液中T细胞下降明显，有统计学意义，在接毒后的第4天下降到最低值：CD3+T细胞占淋巴细胞的百分比由59.6下降到44.
15、4；CD4+T细胞占淋巴细胞的百分比由46.5下降到35.4；CD8+T细胞占淋巴细胞的百分比由14下降到9.4。 36人类疾病动物模型感染小鼠细胞因子变化u非特异性免疫因子IL-18出现明显上升，感染第5天达到最高3133.5 pg/mL；IL-10出现明显上升，TNF-出现缓慢下降趋势。37人类疾病动物模型u特异性细胞因子： IFN-感染前期出现缓慢下降、IL-2未见明显变化； IL-4感染后期明显上升；38人类疾病动物模型模型优缺点u能够引起感染动物死亡，ST50在5.25d，显示与人相似的病理特征，有效应用于抗禽流感药物的研究。u体温下降，不能形成肺外器官感染，不能观察到肺泡II细胞的
16、增生。39人类疾病动物模型恒河猴感染H5N1流感病毒u通过“环甲膜穿刺术”经气管注射7ml病毒液/只；u感染猴不出现死亡；u采用不同时间段检查猴感染状况，30h，80h，240h，336h。40人类疾病动物模型模型指标u体温变化：染毒后第12h出现上升，最高可达41.2，第36h后体温在正常水平范围波动。41人类疾病动物模型u呼吸频率：变化染毒后，第12h呼吸频率出现上升，36h呼吸频率达最高峰（120次/min），随后逐渐回落，第84h后在正常水平范围波动。42人类疾病动物模型病理变化感染30h，2/3的左肺叶及右肺门处可见暗红色肝样变区，水肿渗出；显微镜下，肺组织实变严重，大量红细胞和炎性
17、细胞侵润及纤维素渗出43人类疾病动物模型染毒后第72h最为严重，水肿渗出严重，左肺叶大部分呈暗红色肝样变，病变区质实，切面呈红褐色，可见较多粉红色泡沫状液体渗出；双肺的胸膜均光滑，胸腔内无明显积液，肺动脉分支内未见血栓显微镜观察，肺组织实变严重，可见大量红细胞和炎性细胞侵润及纤维素渗出 44人类疾病动物模型感染后第240h，肺组织病变区缩小，大约1/3的左肺叶及右肺门处可见暗红色肝样变区，水肿渗出减轻。显微镜观察，肺泡壁增厚， 型肺泡上皮增生。45人类疾病动物模型电镜观察u在染毒后第72h，在肺泡腔肺泡上皮细胞和内皮细胞间，可见堆集的病毒样颗粒46人类疾病动物模型各组织病毒的检测uRT-PCR
18、检测病毒，在第1天肺与支气管中检出，第3天肺中检出，特异性扩增条带237bp。感染第1天RT-PCR检测结果感染第3天RT-PCR检测结果47人类疾病动物模型感染肺组织免疫组化结果u免疫组化在肺支气管上皮细胞与肺巨噬细胞中检出阳性，染成棕黄色。48人类疾病动物模型抗体的变化u感染第7天，恒河猴体内特异性抗体逐渐上升，感染至90天时仍然维持较高水平。49人类疾病动物模型T淋巴细胞的变化 细胞免疫功能受损，CD3+T淋巴细、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞均出现短暂的下降（第1天和第2天），感染第7天逐渐恢复回升至正常。50人类疾病动物模型模型优缺点uH5N1病毒感染猴与人感
19、染临床症状相似，出现体温升高，呼吸急促等。u出现典型的肺泡II型细胞增生；u不出现死亡，肺外器官感染。51人类疾病动物模型化学诱发性动物模型 I型糖尿病模型病理变化链脲佐菌素iv临床指标摄食量、饮水量、尿量、精神状况与糖代谢有关的生化指标：血糖、甘油三酯、总胆固醇、糖耐量、c肽、谷氨酸脱羧酶抗体 52人类疾病动物模型n临床指标：给药1 月后摄食量、饮水量、排尿量才明显增加，严重者出现行动困难, 反应迟钝, 视力下降, 面部浮肿, 食欲降低, 嗜睡等症状；给药第2周空腹血糖升高, 第7周空腹血糖显著上升, 给药后第5周出现糖耐量异常；C肽下降、GAD-Ab变为阳性。n病理变化：细胞坏死，胰岛萎缩
20、、纤维化53人类疾病动物模型基因修饰动物模型n转基因动物（Transgenic animals)是通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚胎细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。n基因修饰动物模型必须具有疾病特征表现。54人类疾病动物模型n将改建后的目的基因（基因组片段）用显微注射法注入实验动物的受精卵。n将该受精卵再植入受体动物的输卵管(或子宫)中。n发育成携带外源基因的转基因动物。55人类疾病动物模型乙肝转基因小鼠（四环素调控双转基因小鼠）n设计两个载体，建立两类转基因小鼠；n第一类转基因小鼠导入一个受四环素调控的转录激活蛋白，如rTA（Tet-off系统）或rtTA（ Tet
21、-on系统）56人类疾病动物模型n第二类转基因小鼠将要表达的目的基因克隆到TRE启动子的下游，与第一类小鼠交配后，产生两种转基因都为阳性的小鼠，在四环素调控下在小鼠上产生定时定点开放或关闭目的基因的表达。HBV靶基因载体 HBV组织特异性启动子载体57人类疾病动物模型基因敲除小鼠n利用细胞内染色体DNA可以和导入细胞的外源DNA在相同序列区域内发生同源重组现象，在小鼠胚胎干细胞（ES）中定点破坏内源基因，获得从ES细胞发育而来的带有预定基因缺陷的杂合子小鼠，通过遗传育种获得目的基因纯合缺陷的小鼠个体。58人类疾病动物模型构建方法n基因打靶载体的构建；nES细胞的DNA转染和基因剔出阳性细胞克隆
22、的筛选；nES细胞的囊胚注射和胚胎移植；n嵌合小鼠及基因剔出杂合子小鼠获得；n纯合小鼠的获得及表型研究。59人类疾病动物模型n条件基因敲除技术，常用有Cre-Loxp和Flp-FRT定位重组系统。n利用含有Cre酶转基因小鼠和含有Loxp序列的转基因小鼠杂交，在定点部位发生靶基因被敲除，表现出相关表型。60人类疾病动物模型基因敲除糖尿病小鼠nGK/IRS-1双基因剔除小鼠： IRS-l -/-小鼠表现为胰岛素抵抗，但由于细胞代偿性增生，胰岛素分泌增多，糖耐量正常。 细胞特异GK表达降低的小鼠，显示轻度糖耐量异常。 两者杂交产生的GK/IRS-1双基因剔除小鼠，表现型糖尿病症状，既有胰岛素抵抗又
23、有糖耐量异常。61人类疾病动物模型nIR+/-IRS-1+/-双基因剔除杂合体小鼠 IR+/-和IRS-1+/- 单个基因剔除的杂合体小鼠无明显的临床症状。 IR+/-/IRS-1+/-小鼠肝和肌肉中IR和IRS-1表达水平下降60，由胰岛素介导的IR自动磷酸化，IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化，PI3-激酶的p85亚基与IRS-1的结合都减少。 4-6月前小鼠血糖正常，2月时胰岛素水平升高，4-6月时，发生明显的胰岛素抵抗(表现为血胰岛素水平显著升高和对外源性胰岛素不敏感)，6月时，40的杂合体双突变鼠表现糖尿病症状。62人类疾病动物模型善待实验动物63人类疾病动物模型64人类疾病动物模型65人类疾病动物模型
