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1、定量分析方法性能验证（什么是？怎么做？） 王会茹王会茹性能验证根椐美国CLIA,88临床实验室质量保证文件要求，从保证检验质量考虑，实验室在使用新检测系统作患者标本检测前，必须在实验室的具体条件下，用试验去验证检测系统的基本分析性能。只有真正认可了检测系统的分析性能符合本实验室及临床要求，或和厂家的资料一致，才可以用于常规检测。性能验证是通过试验途径测定并评价方法的性能。如精密度和准确度，在试验中测定的是不精密度和不准确度，不论不精密度还是不准确度，强调的都是误差，评价试验的过程就是对误差的测定，因此方法评价的各项试验是配合各种类型的分析误差而设计的。分析误差类型及验证试验分析误差类型验证试验
2、随机误差初步确定重复性（批内） 再现性（批间）恒定误差干扰方法比对比例误差回收性能验证的内容性能验证的内容1.精密度精密度2.准确度准确度3. 不确定度不确定度4.携带污染率携带污染率5.可报告范围可报告范围6.参考区间参考区间7.比对试验比对试验一般要求一般要求试验人员必须掌握仪器操作和维护程序、标本准备方法和校准。对较简单的设备需要5天或更少的时间，对较复杂的多通道设备需要5天或更长的时间。在完成仪器熟悉过程后开始实验并收集数据。评价实验应在操作者完全熟悉实验过程和评价方案以后进行。1 .精密度精密度精密度-在规定条件下获得的独立测量结果之间在规定条件下获得的独立测量结果之间的接近程度。精
3、密度通常用不精密度表示，不精的接近程度。精密度通常用不精密度表示，不精密度用标准差或变异系数表示。标准差越大，精密度用标准差或变异系数表示。标准差越大，精密度越低。密度越低。精密度的内容包括：批内、批间精密度。精密度的内容包括：批内、批间精密度。批内精密度：指在相同条件下（时间、校准、方批内精密度：指在相同条件下（时间、校准、方法、操作者、仪器、环境等）获得的精密度，即法、操作者、仪器、环境等）获得的精密度，即重复性。重复性。批间精密度：是指在一种或几种条件因素发生变批间精密度：是指在一种或几种条件因素发生变化，但在同一实验室内获得的精密度，即再现性。化，但在同一实验室内获得的精密度，即再现性
4、。试验要求：为减少对结果的影响因素，全部实验过程中应使用同一批号的试剂和校准物。实验标本可采用稳定的、以蛋白质为基质、可模拟临床标本特性的产品，如校准品，质控品， 病人标本。必要时，可采用稳定的混合冷冻血清,标本量足够。选择标本浓度时应接近医学决定水平（临床按照不同病情给予不同处理的指标阈值），一般推荐使用二个或二个以上浓度的标本。 医学决定水平项目 医学决定水平 参考范围123钾钾 3.05.87.53.55.3ALT2060300040UREA3.07.114.2 3.6-7.1一个诊断试验一般有3个医学决定水平，提示需要进一步检验的阈值，相当于待诊值。提示需要采取治疗措施的界值，相当于确
5、诊值。提示预后或需要紧急处理的界值，另外有些指标需要设立危急值。实验方案参照NCCLS(美国国家临床实验室标准委员会) EP5-A文件。批内不精密度：取二个水平的新鲜血清或质控血浆，连续重复测定20次，计算SD ,CV。批间不精密度：选择二个水平的新鲜血清或质控血浆，连续重复测定20天，计算SD ,CV。性能要求由临床医学家和临床化学家共同研究制定，既应反映临床应用与解释结果的要求（称医学效用限度），又应基本符合实验室所能达到的技能状态。ISO15189认可准则不精密度要求：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），重复性精密度1/4 TEa,中间精密度1/3TEa.评价标准项目1
6、/3TEa 1/4 TEa1/3CLiA88北京市我科室内质控K3.432.583.0 -5.564.0 -4.176.0 -2.773.604.0 -1.02Na0.930.70120 1.11130 -1.02150 0.891.90130-0.97CL1.671.2590 -1.67110 -1.671.80110-1.21GLU3.332.502.78 3.956.99 -3.334.302.05TP3.332.503.332.50ALT6.675.06.676.02.54UREA3.02.253.05.32.75CREA5.03.753.53.822准确度准确度：是一次测量结果与被测
7、量真值的接近程度。它涵盖正确度和精密度，他往往以不准确度来衡量，不准确度的数字表达是不确定度。正确度：大量测得均值与真值的一致程度。是系统误差分量的度量，以偏倚来表示。偏倚越大，正确度越差。精密度：在规定条件下，独立测试结果间的一致程度。是随机误差分量的度量，以标准差来表示。标准差越大，精密度越低。准确度、正确度、精密度关系从字面上准确度、正确度往往使人困惑，但从实验误差理论来解释就比较容易理解。正确度是系统误差分量的度量；精密度随机误差分量的度量。要做到准确度高，第一要求正确度高，无偏倚或偏倚小，这就需要由大量测试结果的平均值与参照值进行比较才能求出，也就是系统误差小；第二要精密度高，即随机
8、误差要小，试验重复性好。这样只有正确度和精密度都高的结果其准确度才高。准确度、正确度、精密度关系准确度、正确度、精密度关系1图：正确度、精密度都高，因而准确度也高。2图：精密度高，正确度不好，存在偏倚，因而准确度不好。3图：正确度、精密度都不好，既有系统误差存在，随机误差又很大。4图：精密度不好，但正确度好，但离散程度很大，无法保证准确度的可靠性。通过正确度、精密度这两个指标，才能完整体现检测结果的准确程度。准确度评价方法1根据NCCLS EP9-A2文件，将检测系统通过具有溯源性的校准品校准后，检测两个浓度定值质控品，连续检测3次取平均值计算其相对偏倚。若相对偏倚%在规定的允许限制内，结果可
9、接受，其准确度可被认可。 均值-靶值偏倚= - % 靶值准确度评价方法2参加室间质量评价项目，采用卫生部临检中心室间质量评价结果，若年度室间质评成绩均为合格，取每个项目一年平均偏倚值判断准确度；如果没有参加室间质量评价的项目，可选取五份临床样本，与其他实验室进行比对，判断该实验的准确性。准确度评价方法2凝血酶原时间 PT（秒） 样本编号 我室结果 靶值 偏倚（% ）201211 11.4 12.0 -5.00 201212 11.5 12.0 -4.17 20121324.2 24.10.41 201214 23.8 24.2-1.65 20121546.6 49.3-5.48 3.不确定度-
10、评估不准确度的试验表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数，称为测量不确定度。在实际使用中可根据表示方法分为标准不确定度和扩展不确定度。标准不确定度：以标准差表示的测量不确定度。扩展不确定度：确定测量结果区间的量，合理赋予被测量之值分布的大部分可望含于此区间。溯源性通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是国家标准或国际标准联系起来的特性。溯源真值（sI单位）决定性方法 一级参考物质 参考方法 二级参考物质溯源 厂家常规方法 校准品 实验室常规方法观测值 溯源为了结果更加准确，分析系统应具有完整性、有效性和适用性。即试剂、校准
11、品、质控品、消耗品应配套使用。使用非配套分析系统的实验室应按照NCCLS-EP9的要求与配套分析系统的结果进行比对，以验证分析系统的有效性。 测量不确定度的计算：测量不确定度估计值可通过单个分量方差相加合成测量过程多个分量估计值，然后取合成方差的平方根。 U=（批内变异的平方+所有定标品不确定度的平方）的平方根。其中选择医学决定水平附近的常规非溶血标本，（检测次数=20）；厂家提供定标品的不确定度与溯源性。扩展不确定度计算：将不确定度估计为正态分布，取K=2代表具有95%置信区间，U=Uc2生化组项目不确定度项目 仪器 定标品 试剂 样本Uc 校准品Uc 测量Uc 扩展UcGLU Olympu
12、s AU640生化分析仪 Olympus Olympus 10.111.012.02TP Olympus AU640生化分析仪 Olympus Olympus 0.56 0.80.981.964.携带污染率 携带污染：由测量系统将一个检测样品反应携带到另一个检测样品反应的分析物不连续量，由此错误地影响了另一个检测样品的反应量。原因:数十个项目共用试剂针，样品针，搅拌棒，管道等；使用维护不当，管道污垢积聚；仪器使用时间过长，部件老化冲洗能力降低；试剂组成成分影响前后检测项目的结果，检测项目排列不合理。试验方法1携带污染率操作： 共检测29次。高值血清；生理盐水；样本1:1000稀释后 2计算：盐
13、水平均值为A，稀释后样本均值为B， A交叉污染率=-100% B*10003判断：0.3%为正常。试验方法2操作方法：1取检测结果异常高值血清标本，连续作3次。2取检测结果低值（在参考区间下限附近）血清标本，连续作3次。3按照下面公式计算携带污染率： A1-A3携带污染率=- B3-A3其中B3代表第3次高值，A1代表第次1低值，A3代表第3次低值。3评价标准：携带污染率10%(厂家标准)。5.可报告范围验证可报告范围（线性范围）：指系统最终的输出值与被测分析物的浓度成正比的范围，即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特性。可报告范围指方法直接测量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或其
14、他预处理等非通常检测过程部分。 常规方法应具有较宽的分析范围，一般覆盖健康人参考范围和临床可能出现的高值。DXC600线性范围项目标本K血清 115尿 2300Na血清 100200尿 10300cl血清 50200尿 15400MTP脑脊液60300尿6150ALT5400验证方法1参考（参考（NCCLS ）EP6-P2文件及相关文件。文件及相关文件。1材料：选取新鲜患者血清标本高值、低值材料：选取新鲜患者血清标本高值、低值各一份，（临床无法找到高值样本，也可各一份，（临床无法找到高值样本，也可使用高值质控血清代替）高值样本于厂家使用高值质控血清代替）高值样本于厂家说明的线性或线性上限的说明
15、的线性或线性上限的30%，低值于厂，低值于厂家说明的线性低限。全部实验和数据采集家说明的线性低限。全部实验和数据采集应在同一工作日内完成。应在同一工作日内完成。方法2.制备稀释物程序：按照下列步骤制备制备稀释物程序：按照下列步骤制备5份份样本。样本。 低浓度低浓度X1 高浓度高浓度X5 中间浓度中间浓度X2：3份份X1+1份份X5 中间浓度中间浓度X3：2份份X1+2份份X5 中间浓度中间浓度X4：1份份X1+3份份X53 标本被测物浓度计算：标本被测物浓度计算： X1*V1+X5*V5 被测物浓度被测物浓度= - V1+V5 X样本浓度，样本浓度，V为样本体积为样本体积4 方法：每个检测项目
16、的方法：每个检测项目的5个不同浓度的样本分别个不同浓度的样本分别作重复作重复3次计算均值，检测步骤同临床标本，结果次计算均值，检测步骤同临床标本，结果填入记录表。填入记录表。工作表理理论浓度度 测定定浓度度 均值均值666661391381381381382782782772792784174104114114115565455465435455 数据统计判断：数据统计判断：5.1 以理论计算值为以理论计算值为X轴，测定值均值为轴，测定值均值为Y轴作散轴作散点图。点图。5.2 实实 测值与理论值的比较，偏差应测值与理论值的比较，偏差应10%。5.2 利用利用NCCLS EP6-A推荐的多项式回
17、归分析推荐的多项式回归分析方法判断统计学标准线性，计算方程方法判断统计学标准线性，计算方程Y=aX+b,要要求求a=10.05，r0.975，则可直接判断该测定方法，则可直接判断该测定方法检测范围在试验已涉及范围。检测范围在试验已涉及范围。方法6参考区间参考区间：是在上、下参考限之间的参考值的分布范围。依据参考值的分布和临床使用要求，选择合适的统计方法进行归纳分析，确定参考分布中的一部分为参考区间。通常确定的百分范围为2.5%97.5%之间。临床结果如果在确定的参考区间内，临床上视为“正常”；超出参考区间则视为“异常”。参考区间的制定参考个体参考个体 组成参考人群参考人群 选定参考标本参考标本
18、 通过测定获得参考值，参考值， 计算参考限参考限 确定参考区间参考区间参考区间验证确定参考区间费时费力，希望每一个实验室都能制定出自身的参考区间并不现实。所以临床实验室越来越依赖于其他实验室或诊断试剂制造商提供可进行转换的、符合要求的参考值。参考区间来源常规化学项目参考区间来源：朱丽华主编，王淑娟主审新编简明医学检验参考值手册。胡亚美，江载芳主编实用儿科学。第三版临床检验操作规程厂家试剂说明书。方法：选20例参考个体 （能代表本实验室健康人群，符合相应排除、分组标准），对测试结果进行检验，确保其能够代表具有相同统计学意义的结果组，即没有一个结果为离群值。发现明显离群值，要使用新标本进行替换，直
19、至20例测试结果没有离群值。判断离群点的方法对于特定浓度Yi值的离群点进行检测时，需将其4个重复值从大到小排列（Yi-1到Yi-4）。计算级差D=Yi-1Yi-4。若Yi-1可能是离群点，计算D1=（Yi-1Yi-2）/D。若Yi-4可能是离群点，计算D4= （Yi-3Yi-4）/D。计算结果（D1或D4）如果大于0.765（0.05）或0.889（0.01），则该点判为离群点。 方法 20例测试结果中不超过2个数值落在（10%的结果）的检测值在参考区间外，则已知的生物参考区间可以接受；若3例及以上超过界限，再选择20个参考个体进行验证，少于或等于2个检测值超过已知参考限，则已知参考区间可以接
20、受，若又有3个以上超出参考限，则应考虑建立自己的参考区间。儿研所参考区间验证2011年10月生免组进行生物参考区间验证时发现，检测项目直接胆红素有70%不符合，检测结果均低于目前提供的参考区间下限（1.713.2），查阅相关资料（厂家：3.4；临床检验操作规程：03.4），发现原来参考区间已不适合临床，故本室根据相应患者群体自行确定参考区间。7.比对试验比对试验是用来检查系统误差（偏倚）的有效方法，用于确认同一患者在不同仪器上测定结果的可比性。比对试验启动：比对试验用于试剂、校准物批号改变；仪器部件的更换或进行重要维护程序；质量控制结果失败；能力验证或室间质量评价失败。比对试验目的维持可比性涉
21、及仪器标准化和校准，通过数学转换使得不同测量系统结果强制一致，或在患者报告中采用清楚地表示不同的参考区间。比对试验方案用标准物质按与分析样品的同样方法进行检测，结果采用回归分析比对。用标准方法与试验方法对同一试样进行比对试验。将样本安排给不同的分析人员同时进行试验，把他们的试验结果进行比对。将样本送交其他实验室进行分析，与自己结果进行比对。比对试验样本选择：新鲜患者样本是理想材料；具有互通性性的参考物和控制物；用于室间质量评价、能力验证的材料。浓度要求：分析物浓度具有测量不精密度可靠的估计。多数实验室没有足够资源监测整个分析测量范围的不精密度，所以可选择在接近质量控制物浓度水平执行可比性检验。
22、比对试验要求ISO15189认可准则实验室内分析系统定期比对要求：样本数20例，浓度应覆盖测量范围，应包括医学决定水平，计算回归方程，计算在医学决定水平下的系统误差（偏倚）应小于1/2TEa.比对方法参考（参考（NCCLS ）EP9文件及相关文件。文件及相关文件。样本选择：样本选择：40例新鲜血清，覆盖检测范例新鲜血清，覆盖检测范围，包括医学决定水平，均匀分布。围，包括医学决定水平，均匀分布。测定步骤：每天选择测定步骤：每天选择8份样本在不同检测系份样本在不同检测系统做双份测定，即从统做双份测定，即从18再由再由81分别用分别用两种顺序作两遍两种顺序作两遍,最少重复最少重复5天天 。160份数
23、据填入记录表。观察结果有无明显份数据填入记录表。观察结果有无明显的数据错误，若有明显异常时，应判断是的数据错误，若有明显异常时，应判断是否为离群点。否为离群点。 比对方法离群点判断：需将其离群点判断：需将其4个重复值从大到小排列个重复值从大到小排列（Yi-1到到Yi-4）。）。计算级差计算级差D=Yi-1Yi-4。若若Yi-1可能是离群点，计算：可能是离群点，计算：D1=（Yi-1Yi-2）/D。若若Yi-4可能是离群点，计算：可能是离群点，计算：D4= （Yi-3Yi-4）/D。计算结果（计算结果（D1或或D4）如果大于）如果大于0.765（0.05）或）或0.889（0.01），则该点判为
24、离群点。），则该点判为离群点。 比对方法数据分析数据分析:数据统计整理，数据统计整理，确定实验样本确定实验样本无无离群值离群值。离群点离群点2个或者以内，保留全部数据。个或者以内，保留全部数据。离群点离群点2个以上，重新实验。个以上，重新实验。比对方法比较方法结果作为比较方法结果作为x轴，试验方法作为轴，试验方法作为y轴，轴，作直线回归图，评价相关性作直线回归图，评价相关性，计算偏倚。，计算偏倚。结果判定：相关系数越接近结果判定：相关系数越接近1.0，斜率越接，斜率越接近近1.0，截距越接近，截距越接近0，准确度越高。，准确度越高。比对结果项目 dsc800OlympusY=aX+bR值Tp6
25、8.510.268.310.5Y=0.991X+0.1820.990简单比对方法至少选择5个不同浓度水平的病人的新鲜血清标本。所选标本浓度范围应在该项目的医学决定水平范围和分析测量范围，且均匀分布。结果判断：两个检测系统间测定结果的相对偏差不超过1/2TEa.5份样本检验结果至少4份比对合格，则为检验结果比对合格。FIB比对结果标本号X1X2均值y1y2均值偏差13.263.323.293.032.932.989.42%234567儿研所性能数据项目准确度 精密度可报告范围参考范围不确定度批内N批间N批内P批间PALT3.75 1.88 2.52 1.12 1.44 115280-40TP2.83 1.12 2.03 1.21 2.07 27.71356080 0.98谢谢！
