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1、11DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具12基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 高频考点突破高频考点突破11DNA重重组组技技术术的的基基本本工工具具基础自主梳理基础自主梳理命题视角剖析命题视角剖析即时达标训练即时达标训练12基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序基础自主梳理基础自主梳理一、一、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”(1)主要来源：原核生物。主要来源：原核生物。(2)特点：能够识别特点：能够识别DNA特定的特定的_，切开两个核苷酸之间的切开两个核苷酸之间的_。(3)DNA末端：限制酶切割末端：限
2、制酶切割DNA产生的产生的DNA末端末端有两种形式：有两种形式：_和平末端。和平末端。核苷酸序列核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端2DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”(1)作用：将双链作用：将双链_“缝合缝合”起来，恢起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_。(2)种类种类EcoliDNA连接酶：只能缝合连接酶：只能缝合DNA的黏性末端的黏性末端.T4DNA连接酶：既可缝合连接酶：既可缝合DNA的黏性末端，又的黏性末端，又可缝合双链可缝合双链DNA的的_。3基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”(1)载体的种类
3、载体的种类质粒。质粒。噬菌体的衍生物。噬菌体的衍生物。动植物病毒。动植物病毒。DNA片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键平末端平末端(2)质粒载体的特点质粒载体的特点能够在细胞内自我复制。能够在细胞内自我复制。具有一个或多个具有一个或多个_，便于供，便于供外源外源DNA片段插入其中。片段插入其中。具有特殊的遗传标记基因，供重组具有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的的鉴定和选择。鉴定和选择。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取目的基因的获取(1)目的基因：指编码蛋白质的目的基因：指编码蛋白质的_。(2)获取目的基因的方法获取目的基因的方法从基因文库中获取目的基因从基因文库
4、中获取目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点结构基因结构基因受体菌受体菌所有所有c目的基因的获取依据：目的基因的获取依据：()基因的核苷酸序列；基因的核苷酸序列；()基因的功能；基因的功能；()基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；()基因的转录产物基因的转录产物mRNA；()基因的翻译产物蛋白质。基因的翻译产物蛋白质。利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因aPCR的含义：是一项在生物体外的含义：是一项在生物体外_特定特定DNA片段的核酸合成技术。片段的核酸合成技术。b条件：已知基因的核苷酸序列。条件：已知基因的核苷酸序列。c过程：目的基因受热形成单链过程：目的基因受热形成单链DN
5、A，与引物，与引物结合，在结合，在_的作用下延伸形成的作用下延伸形成DNA。d方式：指数扩增方式：指数扩增2n(n为扩增循环的次数为扩增循环的次数)复制复制DNA聚合酶聚合酶元贝驾考 http:/ 元贝驾考2016科目一 科目四驾考宝典网 http:/ 驾考宝典2016科目一 科目四人工合成法：若基因较小、核苷酸序列已知，可人工合成法：若基因较小、核苷酸序列已知，可以人工合成。以人工合成。2基因表达载体的构建基因表达载体的构建(1)表达载体的组成：目的基因表达载体的组成：目的基因_终止子终止子标记基因。标记基因。(2)表达载体的功能表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给使目的
6、基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。下一代。使目的基因使目的基因_和发挥作用。和发挥作用。(3)启动子：位于基因的启动子：位于基因的_，它是，它是_识识别和结合的部位，驱动基因转录产生别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。(4)终止子：位于基因的尾端，终止终止子：位于基因的尾端，终止mRNA的转录。的转录。(5)标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因。标记基因：鉴别受体细胞是否含有目的基因。启动子启动子表达表达首端首端RNA聚合酶聚合酶3将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持受体细胞
7、内维持_的过程。的过程。(1)将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞方法：农杆菌转化法；方法：农杆菌转化法；_枪法；花粉管通枪法；花粉管通道法。道法。(2)将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法：方法：_注射技术。注射技术。操作程序：目的基因表达载体操作程序：目的基因表达载体_取取卵卵(受精卵受精卵)显微注射显微注射移植到雌性动物移植到雌性动物体内体内新性状的动物。新性状的动物。稳定和表达稳定和表达基因基因显微显微提纯提纯(3)将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、多为原核生物特点：繁殖快、多为_、遗传、遗传物质少。物质少。转化：用转化：用Ca2
8、处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合促感受态细胞促感受态细胞吸收吸收DNA分子。分子。单细胞单细胞4目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定(1)检测检测方法：采用方法：采用_技术，抗原抗技术，抗原抗体杂交技术。体杂交技术。内容：内容：a检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上的目的基上的目的基因。因。b检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了_。c检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成_。(2)鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。DNA分子杂交分子杂交mRNA蛋白质蛋白质高频考点突破高频考点突破考点
9、一考点一基因工程的基本工具基因工程的基本工具【易误警示易误警示】限制酶与限制酶与DNA连接酶的关系连接酶的关系限制酶不切割自身限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶起作用时不需要模板。连接酶起作用时不需要模板。即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)1(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙下列关于基因工程的叙述，错误的是述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物微生物B限制性核酸内切酶和限
10、制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常连接酶是两类常用的工具酶用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达的细胞和促进目的基因的表达解析：解析：选选D。基因工程中目的基因来源于自然界中。基因工程中目的基因来源于自然界中的含有目的性状的一切生物，可以是动物、植物，的含有目的性状的一切生物，可以是动物、植物，也可以是真菌、细菌，还可以是人等；在基因工也可以是真菌、细菌，还可以是人等；在基因工程中获取目的基因以及将目的基因和载体结合构程中
11、获取目的基因以及将目的基因和载体结合构成基因表达载体必须使用同一种限制酶进行切割，成基因表达载体必须使用同一种限制酶进行切割，已获得相同的黏性末端，再在已获得相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用连接酶的作用下，将目的基因和载体连接，构成基因表达载体；下，将目的基因和载体连接，构成基因表达载体；人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌体内得以表达，人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌体内得以表达，但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器的加工，合成的胰岛素原不具有尔基体等细胞器的加工，合成的胰岛素原不具有胰岛素的功能，即没有生物活性；作为标记基因，胰岛
12、素的功能，即没有生物活性；作为标记基因，有利于重组基因在细胞内表达的鉴定筛选，但对有利于重组基因在细胞内表达的鉴定筛选，但对于目的基因的表达没有促进等调控作用。于目的基因的表达没有促进等调控作用。考点二考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1构建基因表达载体构建基因表达载体(核心步骤核心步骤)2将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞(或受精卵)受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵
13、)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。碱基互补配对。工具酶只有两种：限制酶在操作程序工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序连接酶只在操作程序2中用到。中用到。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内目的基因进入受体细胞内，并且在受体
14、细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)2目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有目的基因检测受体检测受体细胞中是否有致病基因细胞中是否有致病基因检测目的基因是否转检测目
15、的基因是否转录出了录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白检测目的基因是否翻译成蛋白质质ABCD答案：答案：C命题视角剖析命题视角剖析视角视角 1 1紧扣教材重点紧扣教材重点基因工程的操作过程分析基因工程的操作过程分析(2011年南京市质量检测年南京市质量检测)已知已知SARS是由是由一种一种RNA病毒感染所引起的疾病。病毒感染所引起的疾病。SARS病毒病毒表面的表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人病人康复后的血清中有抗康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开病毒的疫苗，开展了前期
16、研究工作，其简要的操作流程如下：展了前期研究工作，其简要的操作流程如下：例例例例1 1(1)实验步骤实验步骤所代表的反应过程是所代表的反应过程是_。(2)步骤步骤构建重组表达载体构建重组表达载体A和重组表达载和重组表达载体体B必须使用限制酶和必须使用限制酶和_酶，后者的酶，后者的作用是将用限制酶切割的作用是将用限制酶切割的_和和_连接起来。连接起来。(3)如果省略步骤如果省略步骤而将大量扩增的而将大量扩增的S蛋白基蛋白基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的到表达的S蛋白，其原因是蛋白，其原因是S蛋白基因在大肠蛋白基因在大肠杆菌中不能杆菌中不能_，
17、也不能，也不能_。(4)为了检验步骤为了检验步骤所表达的所表达的S蛋白是否与病毒蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特征，可用蛋白有相同的免疫反应特征，可用_与与_进行抗原进行抗原抗体特异性反应实验，抗体特异性反应实验，从而得出结论。从而得出结论。(5)步骤步骤和和的结果相比，原核细胞表达的的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列蛋白的氨基酸序列_(填填“相同相同”或或“不相同不相同”)，根本原因是，根本原因是_。【尝试解答尝试解答】(1)逆转录逆转录(2)DNA连接载体连接载体S蛋白基因蛋白基因(3)复制合成复制合成S蛋白基因的蛋白基因的mRNA
18、(4)大肠杆菌中表达的大肠杆菌中表达的S蛋白蛋白SARS康复病人康复病人血清血清(5)相同表达蛋白质所用的基因相同相同表达蛋白质所用的基因相同【解析解析】(1)利用利用RNA获取获取DNA，一般采用，一般采用逆转录的方法，在这一过程中需要逆转录酶；逆转录的方法，在这一过程中需要逆转录酶；(2)目的基因与载体结合，先用限制酶在目的目的基因与载体结合，先用限制酶在目的基因和载体上切出相同的黏性末端，将目的基基因和载体上切出相同的黏性末端，将目的基因片段插入载体的切口处，再加入适量的因片段插入载体的切口处，再加入适量的DNA连接酶，将黏性末端连接起来；连接酶，将黏性末端连接起来；(3)选择性扩增后得
19、到的含有遗传信息的选择性扩增后得到的含有遗传信息的DNA片片段段(S蛋白基因蛋白基因)，直接导入大肠杆菌细胞内，在，直接导入大肠杆菌细胞内，在不与其不与其DNA整合的情况下，不进行复制和转录，整合的情况下，不进行复制和转录，得不到相应的蛋白质；得不到相应的蛋白质；(4)通过大肠杆菌合成的通过大肠杆菌合成的S蛋白，结构和功能可能蛋白，结构和功能可能会发生变化，可与人体内产生的抗会发生变化，可与人体内产生的抗S蛋白的抗体蛋白的抗体进行抗原进行抗原抗体特异性反应，以此进行检测；抗体特异性反应，以此进行检测；(5)各种生物都共用一套遗传密码，因此转入相各种生物都共用一套遗传密码，因此转入相同的目的基因
20、，表达出的蛋白质一般应相同。同的目的基因，表达出的蛋白质一般应相同。视角视角 2 2洞察高考热点洞察高考热点基因工程的基本工具基因工程的基本工具(1)获取目的基因时要保证其完整性。获取目的基因时要保证其完整性。(2)质粒的切割要保证标记基因的完整性。质粒的切割要保证标记基因的完整性。(3)非受精卵的植物组织细胞作为受体细胞非受精卵的植物组织细胞作为受体细胞时需用植物组织培养技术。时需用植物组织培养技术。例例例例2 2(2010年高考江苏卷年高考江苏卷)下表中列出了几下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答中
21、箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：下列问题：(1)一个图一个图1所示的质粒分子经所示的质粒分子经Sma切割前后，分切割前后，分别含有别含有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位酶切位点越多，质粒的热稳定性越点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不构建重组质粒，不能使用能使用Sma切割，原因是切割，原因是_。【尝试解答尝试解答】(1)0、2(2)高高(3)Sma会会破坏质粒的抗性基因、外源破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因中的目的基因(4)质粒和含目的
22、基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化(5)DNA连接连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细鉴别和筛选含有目的基因的细胞胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质【解析解析】环状环状DNA分子中磷酸全部参与形成分子中磷酸全部参与形成磷酸二酯键，被磷酸二酯键，被Sma限制酶切开后相当于一个限制酶切开后相当于一个正常的正常的DNA分子，每个分子，每个DNA分子单链各含有一分子单链各含有一个游离的磷酸基团；个游离的磷酸基团；AT碱基对有两个氢键，碱基对有两个氢键，而而GC碱基对有三个氢键，碱基对有三个氢键，GC碱基对含量碱基对含量越多，热稳定性越高；越多，热稳定性越高；视角视角 3 3突破易错疑点突破易错疑点易混淆的几种酶易混淆的几种酶
