《分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、胶回收-EZNAGelExtractionKit实验原理回收柱（硅胶膜）在高盐、低PH值的情况下吸附DNA，在低盐、高PH值的情况下释放DNA。我们知道原理，就知道了影响胶回收的几个影响因素，PH值、高盐试剂、低盐洗脱试剂。实验步骤1.RT-PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下观察。为防DNA损伤，避免长时间的紫外光照射。2.用刀片或凝胶尺切下含有所需DNA带的凝胶，置于1.5ml离心管中，称重。3.往离心管中加入胶重的等量体积的BindingBuffer（即每100mg胶加入100ulBindingBuffer）.4.50水浴10分钟，使凝胶完全熔解，在水浴过程中每23分钟漩涡震荡混
2、匀一次。5.将离心柱放入2ml收集管中，将上一步熔解的凝胶导入离心柱中，10,000g离心1分钟。弃残液。6.将离心柱重新放回收集管；加入300ulBindingBuffer，10,000g离心1分钟。7.弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管，再加入700ulSPWWashBuffer，静置2-3分钟，10,000g离心1分钟。8.重复步骤7一次。9.弃去收集管中的液体，空柱放回收集管，再10,000g离心1分钟。10.将离心柱放入一个干净的1.5ml离心管，加入2050ul去离子水到柱子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的GAPDH基因DNA片段。连接1）在微量离心管
3、中配制下列DNA溶液，全量为5l。pMD18-TVector*11lDNA0.1pmol0.3pmoldH2Oupto5l2）加入5l（等量）的SolutionI。3）16反应30分钟。pMD18-TVector图谱转化转化(Transformation)：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。CaCl2转化原理正在生长的大肠杆菌在0C下加入到低渗的冰冷
4、的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）。感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的羟基钙磷酸复合物。42C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。转化步骤1.于超净台中取连接产物10l与100l大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。2.42热休克90秒，置冰浴中3-5分钟。3.于超净台中加LB培养基900l，37水浴1小时。4.4000rpm离心3分钟，弃上清，取残余液体重悬细菌。4.取l上述混合物均
5、匀涂布于含100g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。5.37孵箱培养1216小时，可见长出单菌落。6.挑选单菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，或提质粒酶切、测序鉴定。质粒提取-E.Z.N.APlasmidMiniprepKitI原理：原理：在pH12.012.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA
6、尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。步骤：步骤：挑选一个单菌落,37过夜培养1416小时。取1.55ml菌液，10,000g离心1分钟。弃上清，加入250l溶液I/RNase，漩涡震荡重悬细胞。加入250l溶液，轻柔上下颠倒旋转混匀46次，室温放置2分钟。加入350l溶液，轻柔上下颠倒混匀得到白色沉淀。10,000g离心10分钟。将上清转移到HiBindTMDNA柱上,置于2ml离心管上。注意不要吸到沉淀。10,000g离心1分钟，弃残液。用500lHBbuffer洗柱，10,000g离心1分钟，去残液。用700lDNAwashbuffer(乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1
7、分钟，去残液。用700lDNAwashbuffer第二次洗柱10,000g离心1分钟，去残液。空柱子10,000g离心1分钟。将HiBindTMDNA转移至一干净的1.5ml离心管，于膜中央加入50lddH2O或TE溶解质粒。10,000g离心1分钟收集质粒。核酸定量核酸的定量的方法： （1）电泳比较法）电泳比较法。（2）紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法比较常用核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为测定核酸溶液度提供了基础。A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长紫外分光光度法原理测定核酸溶液在260nm的光吸收，样品溶液吸收光的量(吸光度)正比
8、于溶液中溶质的量。吸光度与溶液中核酸浓度间的转换关系依据Lambert-Beer定律：A=260CL其中：A：吸光度(OD)260：溶液中核酸在260nm的摩尔消光系数(单位，L/mol.cm)C：溶液浓度(单位，mol/L)L：光路长度(单位，cm)核酸纯度分析A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否纯化样品。酶切限制性核酸内切酶（restrictionendonucle
9、ase）一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶.在分子生物学分子生物学与遗传工程遗传工程领域作为工具酶有广泛的应用.根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。 鉴定正反TA克隆有两种插入方式，造成正反向常规PCR使得3端多出一个A碱基5nnnnnnnnnnA33Annnnnnnnnn5pMD18-TVector图谱酶切鉴定1. 建立酶切反应体系：建立酶切反应体系：DNA=1g10Xbuffer23.0l10XBSA3.0lEcoRI0.5lApaI0.5lddH2Oupto30l2.37C酶切2h。3.电泳检测
