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1、一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+H2O3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆
2、菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝
3、大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应是一多聚酶链式反应是一种在体外将少量种在体外将少量DNADNA大量大量复制的技术，此项技术复制的技术，此项技术要求使用耐高温要求使用耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：方法：抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境
4、，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长。物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.
5、4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素氮源：尿素选择培养基选择培养基培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。
6、缺乏脲酶的微才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下
7、计算一定容积里利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.活菌计数法活菌计数法（1 1）常用方法：）常用方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数
8、。代表稀释倍数。 当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。（2）原理：）原理：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，
9、培养计算出个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。两种。一是由于土样不同；一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。二是由于培养基污染或操作失误。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说
10、服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二. .实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤
11、取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要
12、在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数之间、适于计数的平板的平板三三样品的稀释样品的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数
13、数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。. .取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间
14、、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试果同一稀释倍数
15、的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。验不精确，需要重新实验。验不精确，需要重新实验。验不精确，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：252
16、52828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落
17、数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 制定计划制定计划 五五. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过
18、滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :
