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1、天津天士力集团研究院药理所文件编号：常用免疫组织化学染色方法常用免疫组织化学染色方法( ( 一一) )、ABCABC 法：法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯 5 分钟。2.切片经二甲苯 5 分钟。3.无水酒精 30 秒。4.无水酒精 30 秒。酒精 30 秒。酒精 30 秒。酒精 30 秒。酒精 30 秒。酒精 30 秒。自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)2O2甲醇处理切片 10-20 分钟。水洗。抗原修复。洗 3 次，1 分钟/次。加入血清孵育 20 分钟。摔干血清，加入一抗 60 分钟。洗 3 次，2 分钟/次。加入二抗孵育
2、30 分钟。洗 3 次，2 分钟/次。加入 ABC 复合物，孵育 30 分钟。洗 3 次，2 分钟/次。2O2孵育切片 5-10 分钟。洗，水洗。苏木素染核 5-10 分钟。水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。二二) )、LSABLSAB 法。法。(SP(SP 法法)(Labelled streptavidim biotln)(Labelled streptavidim biotln)切片脱蜡至水。15.95%6.95%7.90%8.80%9.70%10.11.0.3%H12.13.14.PBS15.16.17.PBS1819.PBS20.21.PBS22.DAB-H23.PBS24.Harr
3、is25.( (1.(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第1页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第1页天津天士力集团研究院药理所文件编号：2.0.3%H2O2甲醇处理切片 10-20 分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS 洗 3 次，1 分钟/次。6.加入血清孵育 10 分钟。7.摔去血清，加入一抗孵育30-60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入二抗，孵育20 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入 SP 复合物孵育 20-30 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。2O2孵育 5-10 分钟。洗，水洗。苏木素染核 5-1
4、0 分钟。水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。三三) )真空负压真空负压 LSABLSAB 法法切片脱蜡至水。2O2甲醇真空负压处理 5min.水洗。如果需要，可进行抗原修复。洗 3 次，每次 1 分钟。加入正常血清真空负压处理5min。摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入二抗(即连接抗体)真空负压处理 5 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。2O2孵育 5-10 分钟。洗，水洗。28.PBS9.PBS10.11.PBS12.DAB-H13.PBS14.Harris15.( (1.
5、2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.8.PBS9.10.PBS11.12.PBS13.DAB-H14.PBS(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第2页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第2页天津天士力集团研究院药理所文件编号：15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)( (四四)Envision TM Systems.)Envision TM Systems.1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇处理切片 10 分钟。3.水洗。抗原修复。洗 3 次
6、，每次 1 分钟。加入一抗体孵育 30-60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入增强剂孵育 20-30 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育 20-30 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。2O2孵育 5-10 分钟。洗，水洗。苏木素染核 5-10 分钟。水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。五五) )免疫组化双染色法。免疫组化双染色法。( () (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)切片脱蜡至水。2O2甲醇处理切片
7、 10 分钟。水洗。抗原修复。洗 3 次，每次 1 分钟。加入非免疫性动物血清，孵育10 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入第一抗体孵育 60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入生物素化的第二抗体，孵育10 分钟。34.5.PBS6.7.PBS8.9.PBS10.11.PBS12.DAB-H13.PBS14.Harris15.( (1.2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.PBS8.9.PBS10.(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第3页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第3页天津天士力集团研究院药理所文件编号：11
8、.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10 分钟。13.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。14.加入 DAB-H2O2孵育 5-10 分钟。15.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。16.加入双染增强液，孵育10 分钟。加入非免疫性动物血清孵育10 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入选用的第二种抗体孵育60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入生物素标记的第二抗体孵育10 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入 AEC 溶液，孵育 5-10 分钟。自来水洗。苏木素染核 5-10 分钟。
9、水性封片。第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。第 1 次显色也可用 BCIP/NBT 溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。六六) )、免疫组化的双染色法、免疫组化的双染色法( () (Immuno-histochemistry double staining method) (Immuno-histochemistry double staining method)切片脱蜡至水。2O2甲醇处理切片 10 分钟。水洗。抗原修复。洗 3 次，每次 1 分钟。加入选用的第一抗体孵育30-60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。417.18.PBS19.20.PBS21.22.PBS23.24
10、.PBS25.26.27.28.注：1.2.( (1.2.0.3%H3.4.5.PBS6.7.PBS(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第4页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第4页天津天士力集团研究院药理所文件编号：8.加入增强剂孵育 20-30 分钟。9.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育11.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.加入 DAB-H2O2孵育 5-10 分钟13.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。加入选用的第二种抗体孵育60 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入增
11、强剂孵育 20-30 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入 AEC 溶液孵育 5-10 分钟。自来水洗。苏木素染核 5-10 分钟。水性封片。七七) )细胞培养片免疫荧光染色法。细胞培养片免疫荧光染色法。将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。纯丙酮固定 10 分钟。浸洗 3 次，每次 1 分钟。加入选用的第一抗体孵育120 分钟。洗 3 次，每次 2 分钟。加入荧光抗体孵育 60 分钟以上。法 3 次，每次 2 分钟。伊文氏蓝衬染 3 分钟。水洗，蒸馏水洗。水性胶封片或用缓冲甘油封片。八八) )真空负压免
12、疫荧光染色法染细胞培养片。真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。514.15.PBS16.17.PBS18.19.PBS20.21.22.23.( (1.2.3.PBS4.5.PBS6.7.PBS8.0.1%9.10.( (1.(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第5页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第5页天津天士力集团研究院药理所文件编号：2.纯丙酮固定 5-10 分钟。3.PBS 浸洗 3 次，每次 1 分钟。4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15 分钟。5.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15 分钟。7.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。伊文氏蓝衬染 3 分钟。水洗，蒸馏水洗。水性胶封片或用缓冲甘油封片。68.0.1%9.10.(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第6页(完整word版)常用免疫组织化学染色方法(word文档良心出品)-第6页
