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1、第七章第七章 细菌和病毒的遗传细菌和病毒的遗传本章要点本章要点细菌和病毒在遗传研究中的优越性；细菌和病毒在遗传研究中的优越性；温和噬菌体、烈性噬菌体；温和噬菌体、烈性噬菌体；原噬菌体、溶原性细菌与溶原性生活周期。原噬菌体、溶原性细菌与溶原性生活周期。F-菌株、菌株、F+菌株、菌株、Hfr菌株；菌株；F因子、因子、F因子；因子；转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；酵母：酵母：三个字母表明基因功能，后面的数字表三个字母表明基因功能，后面的数字表示基因座。示基因座。啤酒酵母啤酒酵母基因基因:GAL4，CD28蛋白质蛋白质:GAL4，CDC28非洲粟酒酵母非
2、洲粟酒酵母基因基因:gal4，cdc2蛋白质蛋白质:Gal4，Cdc2基因和基因产物的符号基因和基因产物的符号细菌：细菌：用三个引文字母表示。用三个引文字母表示。表型第一个字母大写，用表型第一个字母大写，用正体正体；基因型三个字母都小写，用基因型三个字母都小写，用斜体斜体；肩上的符号表示野生型、突变型、抗性或敏感性。肩上的符号表示野生型、突变型、抗性或敏感性。如：如：表型表型野生型野生型Gal，突变型，突变型Gal或或Gal基因型基因型野生型野生型gal ，突变型突变型gal 或或gal 表型表型AmpRAmpS基因型基因型ampramps果蝇果蝇:以以1-4个字母表示。个字母表示。基因基因:
3、white(w),tailless(tll),hedgehog(hh);蛋白蛋白:White,Tailless,Hedgehog植物植物:没有惯用法，没有惯用法，大多数用大多数用1-3个小写字母表示。个小写字母表示。 Arabidopsis 基因用果蝇的方法命名但用大写字基因用果蝇的方法命名但用大写字母，如母，如基因基因AGAMOUS（AG），蛋白），蛋白AGAMOUS。脊椎动物脊椎动物:一般以一般以1-4个小写字母表示其基因功能。个小写字母表示其基因功能。例如，基因例如，基因sey, myc,蛋白蛋白Sey,Myc人类人类:方法如脊椎动物但需大写方法如脊椎动物但需大写。例如基因例如基因 MY
4、C、SRY，蛋白，蛋白MYC、ENO1。基因产物的命名无统一的规定，现在一般都用基因产物的命名无统一的规定，现在一般都用正体，全部大写，或第一个字母大写，如正体，全部大写，或第一个字母大写，如Gal或或GAL。第一节第一节 细菌和病毒遗传研究的意义细菌和病毒遗传研究的意义一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征二、病毒的生物学特征二、病毒的生物学特征三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性四、细菌和病毒的拟有性过程四、细菌和病毒的拟有性过程五、细菌遗传的实验研究方法五、细菌遗传的实验研究方法一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征1、细菌是、细菌是单细胞生物单细胞生
5、物，完成每个世代只需，完成每个世代只需20分钟，分钟，而且容易得到它的生化突变型。而且容易得到它的生化突变型。2、结构：、结构：鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体（拟核）、核糖体（拟核）、核糖体3、涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内能裂殖、涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内能裂殖107，称为肉眼可见的菌落。，称为肉眼可见的菌落。图图7-17-1大肠杆菌大肠杆菌图图7-2细菌的细胞结构与涂布繁殖细菌的细胞结构与涂布繁殖一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征4、其遗传物质、其遗传物质DNA主要以单个主染色体的形式主要以单个主染色体的形式存在。存在。这种这种DNA与真核生
6、物的与真核生物的DNA不同不同，它不，它不与组蛋白相结合，也不形成核小体的结构是一与组蛋白相结合，也不形成核小体的结构是一个封闭的大环。通常还有一个或多个小染色体个封闭的大环。通常还有一个或多个小染色体(质粒质粒)。5、研究细菌遗传的方法：主要是对细菌菌落形、研究细菌遗传的方法：主要是对细菌菌落形态的遗传研究态的遗传研究(如如图图，霉菌菌落，霉菌菌落)图图7-3霉菌菌落霉菌菌落5、菌落形态性状的突变包括：菌落的形状、颜色和大小等。6、生理特性的突变包括：丧失合成某种营养物质能力的营养缺陷型。7、抗性突变包括：抗药性或抗感染性。二、病毒的生物学特征二、病毒的生物学特征1、病毒是比细菌更为简单的生
7、物，它们也只有一条染色体，即单倍体。有些病毒的染色体是DNA，还有一些病毒是RNA。2、病毒主要是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒。病毒可根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。细菌病毒(Bacterial phage)，称为噬菌体(phage)(如图)，是目前经过广泛研究，了解比较清楚的一种病毒。图图7-4噬菌体噬菌体图图7-5烟草花叶病毒腺病毒烟草花叶病毒腺病毒T4噬菌体爱滋病病毒噬菌体爱滋病病毒RNADNADANRNA图图7-6爱滋病病毒爱滋病病毒三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性世代周期短，繁殖世代所需时间短；世代周期短，
8、繁殖世代所需时间短；易于操作管理和进行化学分析易于操作管理和进行化学分析( (纯培养与代谢产物累积纯培养与代谢产物累积) )；便于研究基因的突变便于研究基因的突变( (表现与选择表现与选择) )；便于研究基因的作用便于研究基因的作用( (突变型生长条件与基因作用突变型生长条件与基因作用) )；便于研究基因的重组便于研究基因的重组( (重组群体大、选择方法简便有效重组群体大、选择方法简便有效) )；遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型。遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型。四、细菌和病毒的拟有性过程四、细菌和病毒的拟有性过程虽然细菌和病毒不具备象真核生物配子进行融合虽然细菌和
9、病毒不具备象真核生物配子进行融合的有性过程，但它们的的有性过程，但它们的遗传物质也能从一个细胞遗传物质也能从一个细胞传递到另一个细胞，并且也能形成重组体传递到另一个细胞，并且也能形成重组体。细菌获取外源遗传物质细菌获取外源遗传物质有四种不同的方式：转化，有四种不同的方式：转化，接合，转导和性导。接合，转导和性导。拟有性拟有性过程的存在是细菌、病毒作为过程的存在是细菌、病毒作为真核生物的真核生物的模型模型研究遗传重组和基因结构研究遗传重组和基因结构的重要的重要前提前提。五、细菌遗传的实验研究方法五、细菌遗传的实验研究方法 1 1、细胞计数、细胞计数( (培养物细胞浓度培养物细胞浓度) ) 2 2
10、、建立纯系的方法、建立纯系的方法 3 3、选择培养法鉴定突变型与重组型、选择培养法鉴定突变型与重组型 4 4、突变型与重组型的批量筛选方法、突变型与重组型的批量筛选方法 1 1、细胞计数、细胞计数( (培养物细胞浓度培养物细胞浓度) )培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：验技术，其基本思路是：对原培养物进行连续稀释；对原培养物进行连续稀释；进行平板涂抹培养；进行平板涂抹培养；由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。图图
11、7-7细胞计数细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)Resultsoftheserialdilutiontechniqueandsubsequentcultureofbacteria图图7-8细菌培养细菌培养 2 2、建立纯系的方法、建立纯系的方法纯培养纯培养挑取由单个细胞繁殖而来的菌落进行培养就可挑取由单个细胞繁殖而来的菌落进行培养就可以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。通常采用通常采用平板表面涂布法平板表面涂布法或或划线法划线法可以获得单可以获得单菌落。这种方法获得的纯系，称为菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯菌种纯”。有时采用显微操纵器进行菌丝尖端切割等
12、方法有时采用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法从单个细胞直接培养建立纯系。采用这种方法从单个细胞直接培养建立纯系。采用这种方法获得的纯系称为获得的纯系称为“菌株纯菌株纯”。图图7-9 7-9 细菌培养细菌培养3、选择培养法鉴定突变型与重组型、选择培养法鉴定突变型与重组型许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。有关。营养缺陷型营养缺陷型的筛选、鉴定：的筛选、鉴定：选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为的生长表现将菌株分为原养型原养型(也称为原生营养型也称为原生营养型)与与营养
13、缺陷型营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长应的营养培养基上生长)。营养突变型的筛选、鉴定方法与红色面包霉生化突变营养突变型的筛选、鉴定方法与红色面包霉生化突变型的鉴定方法基本一致。型的鉴定方法基本一致。4、突变型与重组型的批量筛选方法、突变型与重组型的批量筛选方法选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，效率太低。检测分离含有多种突变型的混和菌株，效率太低。为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计
14、了伯格夫妇设计了影印培养法影印培养法。该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选不同选择培养基择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。定效率大大提高。图图7-10影印培养法影印培养法图图7-11影印培养法影印培养法注意：注意：(1)最初的培养基必须是非选择性的，即各最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长；种突变型都能够在其上生长；(2)必须采用适当的方法如涂布或划线法，必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落
15、之间要分开。以使培养物菌落之间要分开。第二节第二节噬菌体的遗传分析噬菌体的遗传分析一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体二、温和噬菌体二、温和噬菌体三、噬菌体三、噬菌体(T2)的基因重组的基因重组一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体：遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的T偶数偶数系列噬菌体。它们的外貌都象蝌蚪状系列噬菌体。它们的外貌都象蝌蚪状(如如图图)。T偶数系列噬菌体具有偶数系列噬菌体具有六角形的头部六角形的头部，其内，其内部含有部含有双链双链DNA分子分子，尾部包括一个中空，尾部包括一个中空的的针状结构及外鞘针状结构及外鞘。末端是。末端是基盘基盘，由尾丝，由尾丝及尾针组成。及尾
16、针组成。图图7-12一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体T偶数系列噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表偶数系列噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表面时，面时，通过尾鞘的收缩将噬菌体通过尾鞘的收缩将噬菌体DNA经中经中空尾部注入寄主细胞空尾部注入寄主细胞，破坏寄主细胞的遗，破坏寄主细胞的遗传物质，并合成大量的噬菌体传物质，并合成大量的噬菌体DNA和蛋白和蛋白质，组成许多新的子噬菌体，最后使细菌质，组成许多新的子噬菌体，最后使细菌裂解，裂解，释放出无数个子噬菌体释放出无数个子噬菌体。所以这样。所以这样的的T偶数系列噬菌体称为偶数系列噬菌体称为烈性噬菌体。烈性噬菌体。图图7-13烈性噬菌体烈性噬菌体T4噬菌体从大肠杆菌中释
17、放图图7-14烈性噬菌体烈性噬菌体图图7-15烈性噬菌体烈性噬菌体图图7-16噬菌体的溶解性周期噬菌体的溶解性周期二、温和噬菌体二、温和噬菌体温和噬菌体温和噬菌体侵入细菌后，细菌并不裂解，即侵入细菌后，细菌并不裂解，即它们有溶原性的生活周期。例如它们有溶原性的生活周期。例如和和P1噬菌噬菌体可代表略有不同的溶原性类型。体可代表略有不同的溶原性类型。噬菌体附着在大肠杆菌染色体的噬菌体附着在大肠杆菌染色体的gal和和bio位点之间的位点之间的att座位上，它能通过交换而整座位上，它能通过交换而整合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为原原噬菌体噬菌体(图图)。溶原性细菌
18、溶原性细菌是带有原噬菌体基因组的是带有原噬菌体基因组的细菌。如乳酸菌溶原性具有完整的细菌。如乳酸菌溶原性具有完整的噬菌噬菌体基因组体基因组而不被裂解的细菌称为溶原性而不被裂解的细菌称为溶原性细菌。细菌。用温和噬菌体感染细菌并使之成为溶用温和噬菌体感染细菌并使之成为溶原性细菌的过程称为原性细菌的过程称为“溶原化溶原化”图图7-17噬菌体噬菌体图图7-18图图7-19噬菌体特定位点的整合噬菌体特定位点的整合图图7-20噬菌体的溶原性（噬菌体的溶原性（lysogenic)周期及溶解性周期及溶解性(lytic)的转变的转变病毒病毒宿主宿主核酸结构核酸结构染色体类型染色体类型染色体长度染色体长度（m）T
19、-偶数噬菌体偶数噬菌体E.coli双链双链DNA线状；环状排列末端有线状；环状排列末端有RS60T7E.coli双链双链DNA线状；单一顺序线状；单一顺序12E.coli双链双链DNA线状；单股粘性末端线状；单股粘性末端16P22沙门氏菌沙门氏菌双链双链DNA线状；单一顺序线状；单一顺序14174E.coli单链单链DNA环状环状1.8QE.coli单链单链RNA线状线状1.4（呼肠病毒）（呼肠病毒）哺乳动物哺乳动物双链双链RNA几个片段几个片段8.3SV40人类人类双链双链DNA超螺旋环超螺旋环1.7鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠鼠单链单链RNA几个片段几个片段烟草花叶病毒烟草花叶病毒烟草烟草单
20、链单链RNA线状线状RS:重复序列，引自重复序列，引自PeterJ.Russell:1972表表7-1几种病毒染色体的特点几种病毒染色体的特点1、噬菌体遗传学的建立与发展：、噬菌体遗传学的建立与发展：（1）1946年，年，BeadlrA.D.andTatum宣布了宣布了“一基因一酶一基因一酶”学说；学说；（2）LederbergJ.细菌杂交实验报告；细菌杂交实验报告；（3）HersheyA.D.andLuriaS.宣布发现了宣布发现了r，h突变体突变体（4）DelbrukeM.D.andHersheyA.D.各自各自发现噬菌体重组。发现噬菌体重组。三、噬菌体三、噬菌体(T2)的基因重组与遗传作
21、图的基因重组与遗传作图2、噬菌体的突变：、噬菌体的突变：噬菌斑的形态噬菌斑的形态宿主范围宿主范围（1）噬菌斑突变：）噬菌斑突变：T噬菌体的噬菌体的r-突变体（速溶）突变体（速溶）正常噬菌体，正常噬菌体，r+，产生的菌斑小而边缘模糊产生的菌斑小而边缘模糊突变噬菌体，突变噬菌体，r-，产生的菌斑大两倍而边缘清晰产生的菌斑大两倍而边缘清晰（2）宿主范围突变：）宿主范围突变：T2噬菌体的噬菌体的h-突变体突变体正常噬菌体，正常噬菌体，h+，只能以只能以EcoliB株株(Ttor)为宿主为宿主突变噬菌体，突变噬菌体，h-，能以能以EcoliB株和株和B/2株株(Ttos)为宿主为宿主3、T2噬菌体的基因
22、重组噬菌体的基因重组将两种不同的将两种不同的T2突变体进行杂交，对其杂交子代突变体进行杂交，对其杂交子代进行重组分析。进行重组分析。杂交方法：杂交方法：将将Ttor和和Ttos两种大肠杆菌细胞混合；两种大肠杆菌细胞混合；同时接种高浓度的同时接种高浓度的T2噬菌体的噬菌体的h-r+和和h+r-两种突变体，两种突变体，保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染；保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染；两种不同的噬菌体两种不同的噬菌体DNA可能在宿主细胞内进行重组，可能在宿主细胞内进行重组，从而产生从而产生非亲本型子代非亲本型子代h+r+和和h-r-。亲本型亲本型重组型重组型 hr+, h+r双重感染双
23、重感染E.coli进行的进行的 杂交杂交(引自引自Griffiths et al.,1999)图图7-21图图7-22T2噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组h+r-h-r+接种在同时长有接种在同时长有B和和B/2株的培养基上株的培养基上h+r-h-r+h+r+h-r-混浊，大混浊，大透明，小透明，小混浊，小混浊，小透明，大透明，大图图7-23h+r-h-r+培养所产生的四种噬菌斑培养所产生的四种噬菌斑 h+r- h-r- h+r+ h-r+图图7-24噬菌斑噬菌斑4、T2的环形遗传图的环形遗传图Hershey根据根据h+r-h-r+的杂交结果推的杂交结果推测测T2的染色体是线性的。的染色体是线性
24、的。多个多个T2噬菌体的杂交结果显示：噬菌体的杂交结果显示：ra、rb、rc有有4种不同的排列形式。种不同的排列形式。杂交每一基因型的%r+h+r-h+r+h-r-h-重组值rah+xr+h-rbh+xr+h-rch+xr+h-12.034.042.012.05.932.056.06.40.739.059.00.924/100=24.0%12.3/100.3=12.3%1.6/99.6=1.6%rxh+ r+h出现的出现的4 种噬菌斑的数目和求得的重组值种噬菌斑的数目和求得的重组值 （rx代表不同的代表不同的r 基因）基因） 不同的快速溶菌突变型在表型上不同，记作不同的快速溶菌突变型在表型上不
25、同，记作ra, rb, rc。将这几种快速溶菌突变型。将这几种快速溶菌突变型(rx h+)与宿与宿主范围突变型主范围突变型(r+ h) 杂交，结果如下表：杂交，结果如下表：去掉去掉%的重的重组值可组值可作为基因间的图距，用来作基因连锁图。作为基因间的图距，用来作基因连锁图。rahrbhhrc24.012.31.6rahrbrcrahrbrcrahrbrcrahrbrcrbrarch图图7-25 噬菌体噬菌体T2 的环状基因连锁图的环状基因连锁图三个三个r 基因与基因与h 基因的连锁图基因的连锁图4 种不同的基因顺序种不同的基因顺序rc- rb+ rc+ rb-第三节第三节细菌的染色体作图细菌的
26、染色体作图一、转化一、转化（transformation）二、接合二、接合（conjugation）三、性导三、性导（transduction）四、转导四、转导（sexduction)）一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞的DNADNA的交换重组的交换重组可以通过4种方式进行一、转化一、转化转化转化(transformation)：指某些细菌指某些细菌(或其或其它生物它生物)能通过其细胞膜能通过其细胞膜摄取周围介质中的摄取周围介质中的DNA片片段，段，并将此外源并将此外源DNA片段整合到自己染色体组中片段整合到自己染色体组中的过程。的过程。转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细转化现象在细菌中
27、是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共共同特征：同特征：（一）转化过程（一）转化过程1、感受态与感受态因子：、感受态与感受态因子：感受态感受态指细菌能够从周围环境中吸收指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进分子进行转化的行转化的生理状态生理状态。感受态主要受一类蛋白质感受态主要受一类蛋白质(感受态因子感受态因子)影响，感受影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态出现在细菌对数
28、生长后期，并且某一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用例，用Ca2+处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。其感受能力。2、供体、供体(donor)DNA与受体与受体(receptor)细胞结细胞结合合(binding)：结合发生在受体细胞特定部位结合发生在受体细胞特定部位(结合点结合点)；对供体对供体DNA片段有一定要求；片段有一定要求；结合过程是一个不可逆过程。结合过程是一个不可逆过程。3、DNA摄取：摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取当细菌结合
29、点饱和之后，细菌开始摄取外源外源DNA；细菌在摄取外源细菌在摄取外源DNA时，由时，由DNA移位酶移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产降解其中一条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条链拉进细胞中。生的能量，将另一条链拉进细胞中。4、联会、联会(synapsis)与外源与外源DNA片段整合片段整合(integration)：整合整合就是指单链的转化就是指单链的转化DNA与受体与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体体DNA中的过程。中的过程。实际上就是一个遗传重组的过程。因而实际上就是一个遗传重组的过程。因而研究整合的分子机制事实上也为遗传重研究
30、整合的分子机制事实上也为遗传重组的分子机制作出了贡献。组的分子机制作出了贡献。图图 7-26 细细 菌菌 转转 化化 的的 机机 制制 (转转 引引 自自Russell,1992) 转化细胞 非转化细胞 复制 带有杂合DNA片断的染色体 降解 通过双交换进行重组 形成三链联会 一条供体的链进入细胞 供体双链DNA 受体DNA 自然转化自然转化（naturaltransformation）在自然转化中细菌可以自由地吸收在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化。枯草杆菌中的转，通过它来进行遗传转化。枯草杆菌中的转化属于自然转化化属于自然转化。工程转化工程转化（engineered
31、transformation）在这种转化中，细菌发生改变使得它们在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源能摄入并转化外源DNA。E.coli 转化就属转化就属于工程转化。于工程转化。本实验采用质粒本实验采用质粒pUC18转化大肠杆转化大肠杆菌菌DH-5a，通过氨苄青霉素抗性筛选转，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。化子。我们通过一个重要的分子生物学我们通过一个重要的分子生物学实验来介绍实验来介绍细菌工程转化细菌工程转化的过程：的过程：（一）实验材料（一）实验材料大肠杆菌大肠杆菌DH-5a质粒质粒pUC18（ampicillin，AmpR）（二）培养基和试剂（二）培养基和试剂1.LB液体培
32、养基液体培养基(%)2.LB固体培养基固体培养基3.抗生素：氨苄青霉素配制成抗生素：氨苄青霉素配制成100mg/ml备用。备用。4.0.1mol/LCaCl2溶液溶液实验材料和试剂：实验材料和试剂：（三）器材（三）器材接种针接种针10ml移液管移液管50ml塑料离心管塑料离心管5ml移液管移液管90mm培养皿培养皿1ml移液管移液管1.5mlEppendorf管管200ml吸头吸头三角瓶三角瓶15150试管试管冰块冰块试管铝帽试管铝帽封膜封膜纱布盖纱布盖线绳线绳硫酸纸硫酸纸（四）仪器（四）仪器净化工作台净化工作台摇床机摇床机恒温水浴锅恒温水浴锅离心机离心机培养箱培养箱（二）细菌的转化（二）细菌
33、的转化1.取大肠杆菌取大肠杆菌DH-5a新鲜感受态细胞新鲜感受态细胞100ml于于1.5mlEppendorf管中，加入管中，加入50100ng质粒质粒pUC18DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置置30min。2.42热休克热休克120s，不要摇动，不要摇动Eppendorf管。管。3.加入加入LB液体培养基液体培养基900ml，37保温保温60min。4.取取100ml转化液涂布在含氨苄青霉素转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100mg/ml的的LB固体平板上，固体平板上，37倒置倒置培培养养1624h。5观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可观察平
34、板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。进一步提取质粒鉴定。实验步骤：实验步骤：（以下均需无菌操作（以下均需无菌操作）（一）感受态细胞的制备（一）感受态细胞的制备*(二二)、共同转化与遗传图谱绘制、共同转化与遗传图谱绘制利用利用共同转化共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。转化的频率越高，反之越低。因此可能因此可能通过测定两基因共同转化的频率来通过测定两基因共同转化的频率来
35、指示基因间的相对距离。指示基因间的相对距离。图图7-27 通过共转化确定基因的排列顺序通过共转化确定基因的排列顺序(引自引自Russell,1992) 供体供体DNA 供体菌供体菌 p q o受体受体菌的转化菌的转化 转化的基因型转化的基因型 提取提取DNADNA断裂断裂或片段或片段 共转化共转化供体一条供体一条DNA片段上的两个基因同时转化的现片段上的两个基因同时转化的现象称为象称为共转化共转化。应用：应用：两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）转化实验：转化实验：trp2+his2+tyr
36、1+转化转化trp2-his2-tyr1-trp2+his2+tyr1+转化转化trp2-his2-tyr1-实验实验 trp2 34 his2 13 tyr13660二、接合：二、接合：(一一)接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实(二二)F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为(三三)中断杂交试验作图中断杂交试验作图(一一)接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实1、Lederberg和和Tatum大肠杆菌杂交试验：大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌材料：大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株的两个营养菌株的两个营养缺陷型品系：缺陷型品系：A甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷
37、型met-和生物素缺陷型和生物素缺陷型bio-；B苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型leu-。方法：方法：将将A、B混和，在基本培养基混和，在基本培养基(固体固体)上涂布培养。上涂布培养。结果：结果：平板上长出平板上长出原养型菌落原养型菌落(+)。 图7-29 塔特姆塔特姆 （19091975） 图图7-28 莱德伯格（莱德伯格（1925） 图图7-302、几种可能解释及其分析、几种可能解释及其分析对上述试验结果原养型菌落可能产生于：对上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本细菌亲本细菌A或或B发生了发生了回复突变回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料两品系细胞通过培养
38、基交换养料互养作用；互养作用；两品系间发生了两品系间发生了转化作用转化作用；发生细胞融合，形成了发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：行的研究最终表明：这些解释均不成立这些解释均不成立。回复突变可能的排除回复突变可能的排除Lederberg和和Tatum采用的是双营养缺陷型菌株，采用的是双营养缺陷型菌株，已基本排除已基本排除A或或B品系发生回复突变产生原养型细品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。菌的可能。理论分析：理论分析：单基因回复突变的频率约为单基因回复突变的频率约为10-6；双
39、基因回复突变的频率则为双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低；，频率很低；但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。本可以排除回复突变的可能。对照实验对照实验：单独接种，未产生原养型菌落。单独接种，未产生原养型菌落。互养作用及其排除互养作用及其排除试验材料：试验材料：A品系：品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)B品系：品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)试验方法：试验方法：将将A、B品系混合接种在基本培养基表面；品系混合接种在基本培养基表面；短时间后喷短时间后喷
40、T1杀死杀死A品系，使其不能持续产生；品系，使其不能持续产生；thr、leu供供B品系生长品系生长结果与结论：结果与结论：仍然出现原养型菌落仍然出现原养型菌落互养并非前述原养型菌落出现的原因，而可能互养并非前述原养型菌落出现的原因，而可能发生了发生了遗传重组遗传重组转化作用及其排除转化作用及其排除Lederbery和和Tatum曾把品曾把品系系A的培养液经过滤后，加的培养液经过滤后，加入到入到B品系的培养物中，未品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原得到原养型菌落；表明原养型菌落可能养型菌落可能不是由转化不是由转化作用产生作用产生戴维斯戴维斯(Dawis,1950)的的U型管试验型管试验结果
41、：没有得到原养型细菌结果：没有得到原养型细菌结论：细胞直接接触是原养结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件型细菌产生的必要条件图图7-31异核体和杂合二倍体的可能性异核体和杂合二倍体的可能性出现原养型菌落的另一种可能是：出现原养型菌落的另一种可能是：细胞融合产生异核体或双杂合二倍体，类似二倍体生物细胞融合产生异核体或双杂合二倍体，类似二倍体生物的杂合体可产生原养型菌落；的杂合体可产生原养型菌落；异核体异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核；两个或多个细胞核；双杂合二倍体双杂合二倍体则是异核体进一步发生核融合，形成二倍则是
42、异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。体细胞核，核内含有两种遗传物质。但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂时存在，继续培养将发生分离；暂时存在，继续培养将发生分离；对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：后代没有出现预期的性状分离现象。后代没有出现预期的性状分离现象。经过上述分析可以认为：经过上述分析可以认为：在在Lederbery和和Tatum及其它类似试验中，及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为称之为接合。接合。细菌的同
43、宗配合细菌的同宗配合(homothallic)与与异宗配合异宗配合(heterothallic)-认为细菌接合是一个彼此交换遗传物质认为细菌接合是一个彼此交换遗传物质的过程，即细菌的过程，即细菌同宗配合同宗配合。3、W.Hayes的实验（的实验（1952）链霉素处理链霉素处理A菌菌完全培养基培养一段时间完全培养基培养一段时间洗涤离心洗涤离心B菌菌重组体未减少重组体未减少基本培养基基本培养基链霉素处理链霉素处理B菌菌完全培养基培养一段时间完全培养基培养一段时间洗涤离心洗涤离心A菌菌无重组体产生无重组体产生基本培养基基本培养基该实验说明细菌接合过程中该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单遗传物
44、质的转移是单向的向的，即遗传物质从，即遗传物质从A A株转移到了株转移到了B B株。株。Hayes(1952)研究表明：研究表明：大肠杆菌两种不同菌株大肠杆菌两种不同菌株( (品系品系) )接合过程中接合过程中遗传物质的转移是遗传物质的转移是单向单向的（的（异宗配合异宗配合）；）；从而认为大肠杆菌存在两种类型品系：雌从而认为大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的受受体体与与供体供体。接合接合(conjugation)：遗传物质从供体遗传物质从供体(donor)(“雄性雄性”)转转移到受体移到受体(receptor)(“雌性雌性”)的
45、重组过程。的重组过程。图图7-32细菌的接合细菌的接合(二二)F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为1、F因子因子(细菌染色体外的一个决定细菌细菌染色体外的一个决定细菌雄雄性性性别的共价环状性别的共价环状DNA质粒质粒)：Hayes等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内一种供体的能力受细胞内一种致育因子致育因子(fertilityfactor,F因子因子;sexfactor,性因子性因子)控制。携带控制。携带F因子的菌株称因子的菌株称供体菌供体菌或或雄性雄性，用，用F+表示，没有表示，没有F因子的菌株称为因子的菌株称为雌性雌性，用，用
46、F-表示。表示。A(strs)冰箱放置一年冰箱放置一年B(strs) A(strs)“”不育不育A(strr)“”A(strs)诱变诱变B(strs)A(strr)可育可育F因子的发现因子的发现：F因子实际上是一种微小的质粒，一种封闭的因子实际上是一种微小的质粒，一种封闭的环状环状DNA，全长约，全长约94.5kb。F因子结构包含因子结构包含3个个区域：区域：复制起点或原点（复制起点或原点（O）：）：oriT和和oriV致育基因区：这些基因使它具有感染性，其中致育基因区：这些基因使它具有感染性，其中一些基因编码生成一些基因编码生成F纤毛的蛋白质。纤毛的蛋白质。配对区：这一区域有配对区：这一区域
47、有4个插入序列个插入序列（insertionsequence,IS），），通过和宿主染色体上的通过和宿主染色体上的IS同源重同源重组或转座，组或转座，F因子可以整合到宿主的不同位点。因子可以整合到宿主的不同位点。图图7-33F因子的结构因子的结构图图7-34F因子与细菌结构、生理差异因子与细菌结构、生理差异F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。遗传物质。没有没有F因子的细菌称为因子的细菌称为F，F细菌经吖啶橙处理细菌经吖啶橙处理而丢失，成为而丢失，成为F。F因子一经丢失，因子一经丢失，细胞中便不细胞中便不再出现；再出现；F可以和可以和F杂交，而不能和杂
48、交，而不能和F杂交；杂交；FF的杂交后代皆为的杂交后代皆为F，而且可以，而且可以107频率频率获得重组体后代。获得重组体后代。F因子的存在状态因子的存在状态以大肠杆菌为例，以大肠杆菌为例，F因子能够以自主状态存在因子能够以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上，以三种状于细胞质中或整合到细菌的染色体上，以三种状态存在：态存在：没有没有F因子，即因子，即F-；包含一个自由状态的包含一个自由状态的F因子，即因子，即F+；包含一个整合到自己染色体组内的包含一个整合到自己染色体组内的F因子，即因子，即Hfr(highfrequencyrecombination)(如如图图)。图图7-35F因子的
49、存在状态因子的存在状态图图7-36F因子的存在状态因子的存在状态Hfr与与F+的异同：的异同：相同点：相同点：1、和、和F-杂交产生重组杂交产生重组后代；后代；2、杂交是通过接合管、杂交是通过接合管和受体菌相连；和受体菌相连；3、用高剂量链霉素处、用高剂量链霉素处理不影响杂交。理不影响杂交。不同点：不同点：1、产生重组子的频率不、产生重组子的频率不同；同；2、F+F-的后代常为的后代常为F+，而，而HfrF-后代皆为后代皆为F-；3、经吖啶橙处理后，、经吖啶橙处理后，F+会变成会变成F-，Hfr仍为仍为Hfr。图图7-36 F7-36 F因子的存在方式因子的存在方式图图7-37自主状态时自主状
50、态时F因子独立进行分裂因子独立进行分裂2、F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为当当F+细菌和细菌和F-细菌接合时细菌接合时(F+F-)，F因子因子的新拷贝能在接合过程中转移到的新拷贝能在接合过程中转移到F-细胞中去，细胞中去，使使F-细胞转变成细胞转变成F+细胞，在接合管形成后，细胞，在接合管形成后，F+DNA双链之一被切断，从断端转移到双链之一被切断，从断端转移到F-细胞，在那里发生细胞，在那里发生DNA复制。当复制。当F因子复制因子复制完成后，完成后，F-变成变成F+(图图)。图图7-38F因子的杂交因子的杂交当当HfrF-接合时，接合时，F-细菌很少转变成细菌很少转变成Hfr，
51、这是，这是因为当因为当Hfr与与F-接合时，整合的接合时，整合的FDNA从一端被内从一端被内切酶切成单链切口，细菌染色体由这一小段单链切酶切成单链切口，细菌染色体由这一小段单链的的F因子作为前导转移到因子作为前导转移到F-受体，一边进入一边合受体，一边进入一边合成，在大多数情况下，只有一小部分细菌染色体成，在大多数情况下，只有一小部分细菌染色体转移，接合即出现中断，受体细胞仍保持为转移，接合即出现中断，受体细胞仍保持为F-，因为因为F因子仍留在供体内因子仍留在供体内。103当当F+或或Hfr的细菌染色体进入的细菌染色体进入F-后，在一个短时后，在一个短时期内，期内，F-细胞中对某些位点来说总有
52、一段二倍体细胞中对某些位点来说总有一段二倍体的的DNA。这样的细菌称为。这样的细菌称为部分二倍体部分二倍体或或部分合部分合子子。部分供体染色体的。部分供体染色体的DNA称为称为供体外基因子供体外基因子，而宿主的染色体则称为而宿主的染色体则称为受体内基因子受体内基因子，部分二倍，部分二倍体中发生单数交换，可使环状染色体打开，产生体中发生单数交换，可使环状染色体打开，产生一个线性染色体，这种细胞不能成活；一个线性染色体，这种细胞不能成活；只有发生只有发生偶数的交换，才能产生遗传的重组体和片段偶数的交换，才能产生遗传的重组体和片段。(图图)图图7-39F因子的遗传重组因子的遗传重组(三三)用中断杂交
53、试验作染色体连锁图用中断杂交试验作染色体连锁图Jacob,F等人在等人在1961年设计了中断杂交试验，以证年设计了中断杂交试验，以证明接合时明接合时遗传物质从供体细胞的转移是直线式进行遗传物质从供体细胞的转移是直线式进行的，他们把的，他们把Hfr菌株与菌株与F-菌株混合在一起进行杂交培菌株混合在一起进行杂交培养。养。Hfr菌株的基因型是：菌株的基因型是：thr+leu+strsazirtonArlac+gal+F-菌株的基因型是：菌株的基因型是：thr-leu-strrazistonAslac-gal-str代表链霉素，代表链霉素，s代表敏感性，代表敏感性，r代表抗性，代表抗性，+代表代表原养
54、型或抗性，原养型或抗性，-代表营养缺陷型。代表营养缺陷型。每隔一定时间取样，把菌液放在食物搅拌每隔一定时间取样，把菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断杂交。经过稀释，接种器内搅拌，以中断杂交。经过稀释，接种到含有链霉素的完全培养基上，这样将杀到含有链霉素的完全培养基上，这样将杀死所有死所有Hfr细胞，然后对形成菌落的细胞，然后对形成菌落的F-细胞细胞用影印培养法用影印培养法测试其基因型测试其基因型，以便确定每，以便确定每个基因转移到个基因转移到F-细胞的时间细胞的时间(如如图图)。？图图7-40中断杂交试验作图中断杂交试验作图*(三)、中断杂交试验作图图图7-41上图表示利用这个方法所获得的结果，
55、上图表示利用这个方法所获得的结果，thr+最先进入最先进入F-细胞，结合细胞，结合8min后出现重组体，后出现重组体，leu+随后随后0.5min出出现；现；混合混合9min后取样时，开始出现少量对叠氮化物有后取样时，开始出现少量对叠氮化物有抗性的菌落，说明抗叠氮化物的基因此时已进入抗性的菌落，说明抗叠氮化物的基因此时已进入F-细细胞中，但对胞中，但对T1噬菌体来说，全部噬菌体来说，全部F-细胞还属于敏感型，细胞还属于敏感型，说明说明tonA基因还没有进入基因还没有进入F-细胞中。细胞中。混合混合11min后，后，才开始出现抗噬菌体才开始出现抗噬菌体T1的的F-细菌。混合细菌。混合18min和
56、和24min取样时，又分别出现乳糖发酵和半乳糖发酵的取样时，又分别出现乳糖发酵和半乳糖发酵的基因。这说明基因。这说明Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入次进入F-菌株，也就是说，菌株，也就是说，染色体从原点开始以直线染色体从原点开始以直线方式进入方式进入F-细胞的。细胞的。根据中断杂交实验作出的大肠杆菌直线连锁图根据中断杂交实验作出的大肠杆菌直线连锁图0ll lll8.59111825azitonlacgalF根据中断杂交的实验，以根据中断杂交的实验，以Hfr基因在基因在F-细胞中出现细胞中出现的时间为标准，可以作出大肠杆菌的连锁遗传图。的时间为标准，可以作
57、出大肠杆菌的连锁遗传图。用不同的用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验所作出的大肠菌株进行中断杂交实验所作出的大肠杆菌基因连锁图，其基因进入杆菌基因连锁图，其基因进入F-细胞的转移的顺序细胞的转移的顺序不大相同。这个实验进一步说明不大相同。这个实验进一步说明F因子和细菌染色因子和细菌染色体都是环状的体都是环状的；而；而Hfr细胞染色体的形成，则因细胞染色体的形成，则因F因子插入环状染色体的不同位置，因而形成了不同因子插入环状染色体的不同位置，因而形成了不同的的转移原点转移原点和和转移方向转移方向。表表7-2不同不同Hfr菌株的基因转移顺序菌株的基因转移顺序菌株菌株基因转移顺序基因转移顺序HfrH0
58、thrprolacpurgalhisglythiHfr10thrthiglyhisgalpurlacproHfr20prothrthiglyhisgalpurlacHfr30purlacprothrthiglyhisgalHfrHthrprolacpurgalhisglythiHfr1prolacpurgalhisglythithrHfr2lacpurgalhisglythithrproHfr3galhisglythithrprolacpurthrprolacpurgalhisglythl1图图7-42大肠杆菌染色体作图大肠杆菌染色体作图这种方法是根据两个基因作为重组子在这种方法是根据两个基因
59、作为重组子在受体菌中出现，以受体菌中出现，以时间分钟时间分钟作为两个基因作为两个基因间图距单位的。间图距单位的。大肠杆菌大片段染色体的遗传学图就是大肠杆菌大片段染色体的遗传学图就是用这种方法，以用这种方法，以随意的起始点随意的起始点用时间分钟用时间分钟为单位完成的。为单位完成的。如果两个基因间的转移时间小于如果两个基因间的转移时间小于2min，用，用中断杂交法所得的图距不太可靠，应采用中断杂交法所得的图距不太可靠，应采用传统的重组作图法。传统的重组作图法。例如，有两个例如，有两个紧密连锁紧密连锁的基因的基因lac-(乳糖不发乳糖不发酵酵)和和ade-(腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型)，为了求得两个基
60、因间，为了求得两个基因间的距离，可采用的距离，可采用Hfrlac+ade+和和F-lac-ade-的杂的杂交实验。用完全培养基但不加腺嘌呤，可以选出交实验。用完全培养基但不加腺嘌呤，可以选出F-ade+的菌落。的菌落。(四四)重组作图重组作图由于由于ade进入进入F-细胞的顺序较细胞的顺序较lac为晚，因为晚，因此只要此只要ade进入进入F-细胞，细胞，lac自然也已经进自然也已经进入。如果选出入。如果选出ade+同时也是同时也是lac+，说明，说明lac和和ade间没有发生过交换。如果是间没有发生过交换。如果是lac-，说，说明两者之间发生过交换。明两者之间发生过交换。图图7-43图图7-4
61、4两基因间的重组值约等于两基因间的重组值约等于22%。而这两个位。而这两个位点间的时间单位约为点间的时间单位约为1min，可见，可见1个时间单个时间单位位(min)大约相当于大约相当于20%的重组值。根据大的重组值。根据大肠杆菌接合实验的研究，利用中断杂交，肠杆菌接合实验的研究，利用中断杂交，基因重组等方法已绘制出大肠杆菌基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12的环的环状遗传图。状遗传图。图图7-45大肠杆菌大肠杆菌K12的环状遗传图的环状遗传图三、性导与三、性导与F 因子因子1、性导性导是指接合时由是指接合时由F因子所携带的外源因子所携带的外源DNA整整合到细菌染色体的过程。合到细菌染色体的过程
62、。2、F因子的产生：因子的产生：F因子整合到宿主细菌染色体过程是可逆的，因子整合到宿主细菌染色体过程是可逆的，当发生当发生环出环出时，时，F因子又重新离开染色体，然而因子又重新离开染色体，然而F因子偶然环出时不够准确，它携带有大肠杆菌染因子偶然环出时不够准确，它携带有大肠杆菌染色体的一些基因，这种色体的一些基因，这种F因子称为因子称为F因子因子(图图)。图图7-46图图7-47F（lac+）3、雅科等发现一个特殊的雅科等发现一个特殊的Hfr菌株能把菌株能把lac+等位基等位基因高频率地转移到因高频率地转移到Flac-受体。受体。解释：解释：F因子携带因子携带lac+基因进入受体细胞，在基因进入
63、受体细胞，在lac位点成为位点成为部分二倍体，即部分二倍体，即Flac+/lac-，它的表现型是，它的表现型是lac+。部分二倍体部分二倍体Flac+/lac-不稳定：不稳定：如果发生单交换，就会导致如果发生单交换，就会导致F因子整合到受体染色体因子整合到受体染色体上而形成上而形成Hfr品系；品系；如果发生双交换，则只是如果发生双交换，则只是F因子的细菌基因和受体因子的细菌基因和受体染色体上的等位基因之间发生互换。染色体上的等位基因之间发生互换。如果这种部分二倍体不发生重组，那么如果这种部分二倍体不发生重组，那么F因子自主因子自主复制，在细菌细胞中可延续下去。复制，在细菌细胞中可延续下去。4、
64、F和和F因子不同因子不同：F品系转变成品系转变成Hfr品系的频率要高于品系的频率要高于F+；F变成变成Hfr时，时，F因子整合到相同位点上，而因子整合到相同位点上，而F+变成变成Hfr时刻整合到不同位点；时刻整合到不同位点；FF-高频传递特定基因，形成部分二倍体；高频传递特定基因，形成部分二倍体；而而F+F-要么产生要么产生F+但不转移任何基因，要么以但不转移任何基因，要么以10-7将宿主的基因按顺序转入受体，但受体仍为将宿主的基因按顺序转入受体，但受体仍为F-，所转移的基因是不同的。，所转移的基因是不同的。由性导产生的部分二倍体，由性导产生的部分二倍体，一方面一方面为确定等位基为确定等位基因
65、显隐性关系提供了重要方法，因显隐性关系提供了重要方法，另一方面另一方面由于分由于分离出大量的离出大量的F因子，每个因子，每个F因子携带不同的大肠因子携带不同的大肠杆菌的基因，包括全部染色体基因，因此，杆菌的基因，包括全部染色体基因，因此，并发并发性导性导是建立遗传图的另一手段是建立遗传图的另一手段，即两个位点必须，即两个位点必须密切相连才能处在同一个密切相连才能处在同一个F因子上。这样通过两因子上。这样通过两个位点间重组频率的计算就可以获得每个片段的个位点间重组频率的计算就可以获得每个片段的连锁群。连锁群。5、性导的遗传学应用、性导的遗传学应用:性导所形成的性导所形成的部分二倍体部分二倍体可用
66、作可用作不同突不同突变型之间的互补测验变型之间的互补测验，以确定这两个突变，以确定这两个突变是属于同一个基因或者是两个不同的基因。是属于同一个基因或者是两个不同的基因。例如在精氨酸合成中，包括有例如在精氨酸合成中，包括有12个不同的个不同的基因基因(argA、argB、argC等等)，它们的突变都会，它们的突变都会产生相同的表型产生相同的表型其生长依赖精氨酸，其中有其生长依赖精氨酸，其中有4个基因在大肠杆菌的遗传学图谱中靠得很近，个基因在大肠杆菌的遗传学图谱中靠得很近，很难通过重组将它们分开。很难通过重组将它们分开。图图7-48图图7-49相反，如果这两个突变株相反，如果这两个突变株是由同一基
67、因突变引起的，是由同一基因突变引起的， 结果会是怎样的呢？结果会是怎样的呢？如果我们将含有性因子的细菌称为雄如果我们将含有性因子的细菌称为雄株，那么我们已经知道了三种不同的雄株，株，那么我们已经知道了三种不同的雄株，有哪三种？致育因子在三种雄株间是如何有哪三种？致育因子在三种雄株间是如何转换的？它们与转换的？它们与F-菌株杂交结果会怎样？菌株杂交结果会怎样？四、转导四、转导转导转导是指是指以温和噬菌体为媒介以温和噬菌体为媒介所进行的细菌遗传所进行的细菌遗传物质的重组过程。物质的重组过程。黎德伯格等黎德伯格等1956年在伤寒沙门氏菌中发现了转导年在伤寒沙门氏菌中发现了转导现象。现象。他们用一个不
68、能合成苯丙氨酸、色氨酸和他们用一个不能合成苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的营养缺陷型和另一个不能合成甲硫氨酸酪氨酸的营养缺陷型和另一个不能合成甲硫氨酸和组氨酸的营养缺陷型杂交，结果在基本培养基和组氨酸的营养缺陷型杂交，结果在基本培养基上出现原养型菌落。上出现原养型菌落。一）转导的发现一）转导的发现LA22LA2phe- trp- tryr- met+his+phe+trp+met-his-基本培养基培养基本培养基培养是否形成原养型的菌落：是否形成原养型的菌落：否否是是否否单独培养单独培养混合培养黎德伯格将上述两种菌株分别放在戴维斯黎德伯格将上述两种菌株分别放在戴维斯U型管的两臂内，中间用玻璃滤板隔开
69、，以型管的两臂内，中间用玻璃滤板隔开，以防止细胞接触，但可以允许比细菌小的物防止细胞接触，但可以允许比细菌小的物质通过，结果也获得了野生型重组体。这质通过，结果也获得了野生型重组体。这样确定，这种野生型重组体是通过一种样确定，这种野生型重组体是通过一种过过滤性因子滤性因子实现的。以后的研究工作表明，实现的。以后的研究工作表明，这种过滤性因子是噬菌体这种过滤性因子是噬菌体P22。P22的遗传信的遗传信息可以整合到宿主的染色体中。息可以整合到宿主的染色体中。二）普遍性转导二）普遍性转导噬菌体噬菌体P22可以转导沙门氏菌染色体组可以转导沙门氏菌染色体组的任何不同的部分，因此称为的任何不同的部分，因此
70、称为普遍性转普遍性转导导。普遍性转导普遍性转导(generalizedtransduction)，指，指通过噬菌体可以转移细菌染色体上的任通过噬菌体可以转移细菌染色体上的任何基因，如何基因，如P22，P1。P22侵染细菌后，细菌染色体断裂成片段，在形成侵染细菌后，细菌染色体断裂成片段，在形成噬菌体颗粒时，偶尔错误地噬菌体颗粒时，偶尔错误地把细菌染色体片段包把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内装在噬菌体蛋白质外壳内，其中并不包含有噬菌，其中并不包含有噬菌体的遗传物质，这种假噬菌体称为体的遗传物质，这种假噬菌体称为转导颗粒转导颗粒。由于决定噬菌体感染细菌的能力是噬菌体的外壳由于决定噬菌体感染细
71、菌的能力是噬菌体的外壳蛋白质，所以转导颗粒可以吸附到细菌上，并将蛋白质，所以转导颗粒可以吸附到细菌上，并将它的内含物注入受体细菌后，形成它的内含物注入受体细菌后，形成部分二倍体部分二倍体，导入的基因经过重组，整合到宿主的染色体上。导入的基因经过重组，整合到宿主的染色体上。图图7-50普遍性转导的机制普遍性转导的机制转导子：转导子：是指那些通过转导作用能表达外基因是指那些通过转导作用能表达外基因子的受体细胞。子的受体细胞。转导频率转导频率=转导子数转导子数侵染受体的侵染受体的P1颗粒数颗粒数=转导子数转导子数噬菌斑数噬菌斑数+转导子数转导子数利用普遍性转导制作细菌遗传学图，利用普遍性转导制作细菌
72、遗传学图，仅需要温和噬菌体和携带不同遗传标记的仅需要温和噬菌体和携带不同遗传标记的细菌菌株，采用两点或三点转导实验。细菌菌株，采用两点或三点转导实验。一个一个典型的转导实验典型的转导实验是首先筛选出含一个是首先筛选出含一个供体标记的转导子（供体标记的转导子（transductant），然后再分），然后再分析其它供体标记的存在与否。析其它供体标记的存在与否。利用普遍性转导制作细菌遗传学图利用普遍性转导制作细菌遗传学图例如从一个例如从一个a+b+供体到一个供体到一个ab受体的转导受体的转导会产生下列不同类型的转导子，如会产生下列不同类型的转导子，如a+b，ab+，a+b+，如果筛选到其中一个作为供
73、体标记，我们，如果筛选到其中一个作为供体标记，我们就能够获得这就能够获得这两个基因之间的连锁两个基因之间的连锁资料。资料。如果选择如果选择a+转导子作供体标记，则转导子作供体标记，则a-b间的间的重组率为：重组率为：如果选择如果选择b+转导子作供体标记，则转导子作供体标记，则a-b间的间的重组率为：重组率为：。RFab=单个转导子数单个转导子数总转导子数总转导子数即：即：一个以上的基因同时被转导的现象称为一个以上的基因同时被转导的现象称为共转共转导导。共转导也可以用来作图：两个共转导基因之共转导也可以用来作图：两个共转导基因之间的距离可以通过转导来确定，建立精细的结间的距离可以通过转导来确定，
74、建立精细的结构图。构图。中断杂交实验方法复杂，且结果不精确；重中断杂交实验方法复杂，且结果不精确；重组作图构建交互突变的品系也很不容易，而采组作图构建交互突变的品系也很不容易，而采用共转导的方法既简单又精确。用共转导的方法既简单又精确。共转导（共转导（contransduction）：）：例如：如何让利用大肠杆菌例如：如何让利用大肠杆菌P1噬菌体转导产生噬菌体转导产生的部分二倍体来确定基因间的图距和制作细菌的部分二倍体来确定基因间的图距和制作细菌染色体连锁图。染色体连锁图。供体供体thr+ leu+ azir受体受体thr- leu- azisP1噬菌体转导噬菌体转导E. coli用于推断基因
75、顺序的实验数据用于推断基因顺序的实验数据选择标记选择标记非选择标记非选择标记leu+50%=azir 2%=thr+thr+3%=leu+0=azir 以以leu+为选择标记时，同时有为选择标记时，同时有50%的的azir和和2%thr+被转导，这表明被转导，这表明leu靠靠azi较近，而离较近，而离thr较远，所以排列顺序可能是下列二者之一：较远，所以排列顺序可能是下列二者之一：thr -azi-leu thr -leu -azi再考虑以再考虑以thr+选择标记的情况，正确的基因选择标记的情况，正确的基因顺序应该是顺序应该是？分析：分析：三）特异性转导（局限性转导）三）特异性转导（局限性转导
76、）1、定义：、定义：通过通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。象。2、特点：、特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体；噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体；只能转导供体菌的只能转导供体菌的个别特定基因个别特定基因（一般为噬菌（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；体整合位点两侧的基因）；该特定基因由该特定基因由部分缺陷的噬菌体部分缺陷的噬菌体携带；携带；3、缺陷噬菌体的形成：、缺陷噬菌体的形成：缺缺陷陷噬噬菌菌体体是是由由于于其其在在形形成成过过程程中中所所发发生生的的低低
77、频频率率（约约105）“误误切切”，或或由由于于双双重重溶溶原原菌菌的裂解而形成（约形成的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）。缺陷噬菌体）。温温和和噬噬菌菌体体感感染染受受体体菌菌后后，其其DNADNA会会开开环环，以以线线状状形形式式整整合合到到宿宿主主染染色色体体的的特特定定位位点点（附附着着位位点点attachmentattachment）上上，从从而而使使宿宿主主细细胞胞发发生生溶溶原化。原化。该该溶溶原原菌菌被被诱诱导导裂裂解解时时，有有极极少少数数（105）的的 原原 噬噬 菌菌 体体 （ prophage） 发发 生生 不不 正正 常常 切切 离离（abnormalexcesi
78、on），其其结结果果会会将将插插入入位位点点两两侧侧之之一一的的少少数数宿宿主主基基因因连连接接到到噬噬菌菌体体DNA上上（而而噬噬菌菌体体也也将将相相应应的的一一段段DNA遗遗留留在在宿宿主主的的染染色色体体组组上上），通通过过衣衣壳壳的的“误误包包”，就就形形成成了了一一种种特特殊殊的的噬噬菌菌体体缺缺陷陷噬噬菌菌体体（defectivephage）。）。如如: 噬菌体和噬菌体和E. coli 之间有一个同源的特定位点之间有一个同源的特定位点（附着位点），简写为（附着位点），简写为att（attB、attP），），att的的两侧分别为发酵半乳糖的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素
79、的基因或合成生物素的bio基因；基因；正常的正常的 染色体可通过染色体可通过att位点整合到位点整合到E. coli的的染色体中，呈原噬菌体状态，进入溶原周期；染色体中，呈原噬菌体状态，进入溶原周期； 染色体的切离：正常切离和非正常切离（染色体的切离：正常切离和非正常切离（ dgal-缺陷噬菌体缺陷噬菌体）；）；图图7-51缺缺陷陷噬噬菌菌体体的的形形成成由于由于dgal常缺失尾部基因常缺失尾部基因J，多，多不能复制不能复制，dgal侵染侵染gal-菌株时，菌株经诱导使细胞裂解后，菌株时，菌株经诱导使细胞裂解后，在释放出的在释放出的106个噬菌体中只有个噬菌体中只有1个个gal+转导噬菌转导噬
80、菌体感染受体；体感染受体；因此，转导的频率较低因此，转导的频率较低(小于小于106)，故称为，故称为低频转导低频转导(low-frequencytransduction,LFT)。4、低频转导：、低频转导：dgal侵染侵染gal-菌株时可以通过两种不同的菌株时可以通过两种不同的途径进行转导：途径进行转导：一种一种是通过整合形成部分二倍体，但这种是通过整合形成部分二倍体，但这种转导子可因转导子可因的切离、丢失而又回复成的切离、丢失而又回复成gal-品系，品系，因而不稳定。因而不稳定。另一种另一种途径是通过途径是通过携带的携带的gal+和受体的基和受体的基因因gal-进行同源配对，经双交换，产生重
81、组的进行同源配对，经双交换，产生重组的转导子，这种转导子较为稳定。转导子，这种转导子较为稳定。图图7-52噬菌体的噬菌体的LFT5、高频转导、高频转导：当带有当带有gal+的的dgal感染感染E. coligal-()时，通时，通过过dgal和已整合的正常的和已整合的正常的之间通过单交换进行同之间通过单交换进行同源重组可形成源重组可形成双重溶原双重溶原(doublelysoge)细菌。细菌。和和dgal都同步大量复制都同步大量复制，直至细胞裂解释放，直至细胞裂解释放出来，释放出来的出来，释放出来的dgal可感染可感染E. coli gal-受体，从受体，从而进行转导。而进行转导。由于一个细胞能
82、释放出比由于一个细胞能释放出比LFT多得多的多得多的dgal，转导频率较高，故称为转导频率较高，故称为高频转导高频转导(high-frequencytransduction，HFT)。图图7-53噬菌体的噬菌体的HFT比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结合在寄主染色不结合在寄主染色体特定位置上体特定位置上结合在寄主染色体特定位置结合在寄主染色体特定位置上上获得转导噬
83、获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解通过敏感菌的裂解或溶原菌的诱导或溶原菌的诱导紫外线诱导溶源菌紫外线诱导溶源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原一般稳定，非溶原性（不表现出任何性（不表现出任何噬菌体的性状，包噬菌体的性状，包括免疫性）括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性但不表现出其它噬菌体的性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较细菌遗传分析中的基因转移：细菌遗传分析中的基因转移：本章小结本章小结图图7-54转化转化图图7-55接合接合7-56性导性导转导转导
