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1、蛋白质组学蛋白质组学1教育教学背背 景景基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 VS 生命现象的复杂性和多变性 从genomic到proteome2教育教学n对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。 3教育教学nTheeraofomics-basedsciencenGenomics（基因组学）nPost-genomicscience（后基因组时代）nFunctionalgenomics（功能基因组学）Transcriptomics（转录组学）Proteomics（蛋白质组学）Metabolomics（代谢组学）nStructura
2、lgenomics（结构基因组学）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!4教育教学 第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 第三节第三节 蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质组功能模式的研究方法 主要内容主要内容5教育教学 第一节第一节 蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念及发展进展及发展进展6教育教学蛋白质组（蛋白质组（proteome）：）：PROTEins + genOME，意，意思是思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的（基因组表
3、达的所有蛋白质）。所有蛋白质）。1994年由年由Williams和和Wilkins提出，是一个动态的概念，提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组和蛋白质组学的概念7教育教学n对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。局限于一个或几个蛋白质。n同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同况各不相同 。n在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组：蛋白质组：8
4、教育教学蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。生命活动规律。9教育教学主要研究内容主要研究内容 了解某种特定的细胞、组了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种
5、蛋白质分子是如明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。合并且决定其活性的部位。 10教育教学表达蛋白组学表达蛋白组学The study of global changes in protein expressionProteomics蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式The systematic study of protein-protein interactions through the isolation of
6、 protein complexes蛋白质组研究包括两个方面：蛋白质组研究包括两个方面：11教育教学12教育教学 基因组基因组 转录组转录组 蛋白组蛋白组The study of proteins expressed by genomesCompletion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genomeOnly 2-5% of proteins in human genome have been i
7、dentified13教育教学14教育教学功能蛋白质组学功能蛋白质组学(functional proteomics)的提出的提出 n功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。现象相关的所有蛋白质。n介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。15教育教学n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。 n将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的
8、命细胞的“全部蛋白质全部蛋白质”的蛋白质组图谱。的蛋白质组图谱。16教育教学发展进展发展进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：加盟：19961996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（质组研究中心（Australia Proteome Australia Proteome Analysis FacilityAnalysis Facility，APAFAPAF） 17教育教学美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCINCI）投资）投资1 0001 000万万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋美元建立肺、直
9、肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。白质组数据库。NCINCI和和FDAFDA共同投资共同投资数百万数百万美元建立癌症不同美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。白质组研究。 18教育教学CeleraCelera公司投资上亿美元独自启动了全公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的
10、工作。的蛋白质表达数据库的工作。19教育教学1997年召开了第一次国际年召开了第一次国际“蛋白质组学蛋白质组学”会议会议1998年年在在美美国国旧旧金金山山召召开开了了第第二二届届国国际际蛋蛋白白质质组组学学会会议议1999年年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议 20教育教学我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会性的蛋白质组学研讨会 21教育教学2003成成 立立 了了 中中 国国 人人 类类 蛋蛋 白白 质质 组组 组组 织
11、织（ CHHUPO） ， 并并 分分 别别 于于 2003年年 9月月 、2004年年8月月以以及及2005年年8月月召召开开了了中中国国蛋蛋白白质质组组学学首首届届、第第二二届届及及第第三三届届学学术术大大会会，2004年年10月月在在中中国国北北京京召召开开了了第第三三届届国国际际蛋白质组学会议。蛋白质组学会议。22教育教学n 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和计划项目和“863”计划项目计划项目；国家自然国家自然科学基金委员会也将科学基金委员会也将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点列为重点项目。项目。n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺
12、癌蛋白质组我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展研究方面取得了较大的进展。23教育教学第二节第二节蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法24教育教学n研究蛋白质组组成成分、差异和功能主要研究目标 25教育教学（一）蛋白质组研究中的样品制备（一）蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。分进行蛋白质组分析。 n也可以进行样品预分级，即将细胞或组也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。进行研究。 26教育教学样品预
13、分级的主要方法样品预分级的主要方法n蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等n蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等n蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等27教育教学 样品预分级主要作用在于提高样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度敏度。28教育教学组织水平上的蛋白质组样品制备组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组织混杂，临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总
14、是与血管、基质细胞等混杂。细胞总是与血管、基质细胞等混杂。 29教育教学激光捕获显微切割激光捕获显微切割(laser capture (laser capture microdissectionmicrodissection，LCM)LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。确分离特定的细胞或细胞群。30教育教学（二）蛋白质组研究中的样品分离n双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离
15、各种蛋白质的方法。离各种蛋白质的方法。31教育教学32教育教学33教育教学特特 点点n可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配与质谱分析匹配 34教育教学2-DE技术的缺点技术的缺点 极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白白质质，极极大大蛋蛋白白质质、极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰丰度度蛋蛋白白质质用用此此种技术难于有效分离。种技术难于有效分离。 胶胶内内酶酶解解过过程程费费时时、费费力力，难难于于与与质质谱谱联联用用实现自动化。实现自动化。 35教
16、育教学新型非凝胶技术新型非凝胶技术 液相色谱法液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CE36教育教学 （三）常见蛋白质显色技术（三）常见蛋白质显色技术 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色37教育教学常见显色方法比较38教育教学考染和考染和银染的比较银染的比较39教育教学40教育教学41教育教学有机染料和银染有机染料和银染n考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。n胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白
17、质进行修饰而影响质谱分析的结果。n胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。n银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。n这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。42教育教学负负 染染n能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。n结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。n速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。n它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。n该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的
18、使用。43教育教学胶体扩散染料胶体扩散染料n主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。n最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。n这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。44教育教学有机荧光团染料有机荧光团染料n包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。n这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。n这三种染料的电泳染色
19、结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。n在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。45教育教学金属螯合染料金属螯合染料n这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。n其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料。46教育教学（四）凝胶的图像处理分析和胶内酶切（四）凝胶的图像处理分析和胶
20、内酶切n凝胶图像的扫描：n图像加工：n斑点检测和定量：n凝胶配比：n数据分析：n数据呈递和解释：n2-DE数据库的建立：47教育教学48教育教学n目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析:MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinumn这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，49教育教学50教育教学51教育教学正常肝细正常肝细胞和肝癌胞和肝癌细胞的蛋细胞的蛋白质组双白质组双向电泳差向电泳差异表达谱
21、异表达谱园点标记园点标记的点为两的点为两者的差异者的差异蛋白蛋白数字号码数字号码为蛋白质为蛋白质点在参考点在参考胶中的索胶中的索引号引号52教育教学蛋白质的胶内酶切包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程53教育教学54教育教学（五）质谱分析（五）质谱分析样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量定性定性定量定量质谱质谱m/z离子化离子化55教育教学原理n质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。56教育教学2020世纪初世纪初世纪初世纪初2020世纪世纪世纪世纪4040年代年代
22、年代年代2020世纪世纪世纪世纪6060年代年代年代年代2020世纪世纪世纪世纪8080年代年代年代年代J.J. Thomson制成第一台质谱仪制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析主要是用来进行同位素测定和无机元素分析开始用于有机物分析开始用于有机物分析出现了气相色谱出现了气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪成为有机物分析的重要仪器成为有机物分析的重要仪器质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪感应耦合等离子体质谱仪质谱技术发展过程57教育教学Sir Joseph John Th
23、omson - 1906年诺贝尔物理奖年诺贝尔物理奖主要贡献：气态下离子导电的理论和实验探索Frederick Soddy - 1921年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使我们对放射活性物质的认识大大提高，另外他对同位素的起源和性质也作了出色工作。Francis William Aston - 1922年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱方法大规模的研究非放射性元素的同位素；提出整数规则。Hans G. Dehmelt and Wolfgang Paul - 1989年同获诺贝尔物理奖年同获诺贝尔物理奖主要贡献：开发了离子阱质谱技术。Robert F. Curl Jr. & Si
24、r Harold W. Kroto & Richard E. Smalley - 1996年分享诺贝尔化学奖年分享诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱发现富洛伦尼斯（C60-C80，足球烯）John Fenn and Koichi Tanaka with Kurt Wuthrich - 2002年分享诺贝年分享诺贝尔化学奖尔化学奖主要贡献：发展了可用于分析生物大分子的软电离方法。质质谱谱相相关关工工作作的的成成就就58教育教学离子源（离子源（Ion source）n质谱仪的离子源种类主要有：n化学电离源化学电离源(Chemical Ionization , CI )n快原子轰击源（快原子轰击源（Fa
25、st Atomic bombardment, FAB）n电喷雾源电喷雾源(Electron spray Ionization，ESI)n大气压化学电离源大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI)n大气压光学电离源（大气压光学电离源（ Atmospheric pressure photoionization, APPI）n基质辅助的激光解吸基质辅助的激光解吸电离源电离源（ MALDI-TOF ）n电子电离源电子电离源(Electron Ionization EI)59教育教学每一种电离方法都有一定的分子量检测范围 EI/CIE
26、SI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVery PolarNonpolar60教育教学n电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，并得到迅速的发展。n被称做是“软”电离技术，因为：他们在离子化过程中不会破坏分子结构，能实现分子量大于10,000质量单位的生物大分子的质量分析61教育教学横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相
27、对强度横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度。或相对丰度。 乙醇的如下：乙醇的如下：质谱图质谱图62教育教学（六）蛋白质序列测定（六）蛋白质序列测定主要有两种方法： 数据库搜索(Sequence database search): 从头算法 (De novo interpretation)63教育教学两种方法各自的特点n数据库搜索算法将实验质谱与由数据库中的肽序列得到的理论质谱相关联,得到候选肽序列,它对质谱质量n要求不高,能够鉴定复杂的蛋白质样品,前提是待鉴定蛋白质样品的序列存在于数据库中.n从头算法利用实验质谱中谱峰之间的质量差直接计算出肽序列,不需要数据库的辅助,能够鉴定数
28、据库中不存在的新序列,n但是它需要相对高质量的质谱数据64教育教学瑞士的瑞士的SWISS-PROT数数据库拥有据库拥有目前世界目前世界上最大、上最大、种类最多种类最多的蛋白质的蛋白质组数据组数据蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础的标志和基础 65教育教学Mascot Search Engine66教育教学Mascot MS/MS Ions Search67教育教学68教育教学69教育教学70教育教学71教育教学72教育教学73教育教学74教育教学75教育教学76教育教学第三节第三节 蛋白质组功能模式的蛋白质组功能模式的研究方法研究方法77教育教学n揭示
29、蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。主要研究目标 78教育教学（一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰翻译后修饰糖糖基基化化乙乙酰酰化化甲甲基基化化羧羧基基化化二二硫硫键键79教育教学（二）蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质相互作用研究技术n生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用序和协同作用 n新陈代谢以蛋白质复合
30、体或多蛋白质网络协同新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现作用实现 n细胞信号转导及病原体感染和免疫反应细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 80教育教学n1989年年Field 和和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。白质相互作用的方法。n以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。1酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 81教育教学 转录激活因子转录激活因子GAL4的特点的特点nN N端含端含NLSNLS和与酵母和与酵母GAL1GAL1基因
31、启动子上游激活基因启动子上游激活序列序列(UASG)(UASG)结合的结构域结合的结构域nC C端含端含GAL1GAL1转录激活结构域转录激活结构域 82教育教学n功能上相互独立又互相依赖，只有通过某功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性活性 83教育教学系系 统统 构构 建建n分别构建含分别构建含GAL4 BD 和和AD 的两个酵母的两个酵母融合蛋白表达载体；融合蛋白表达载体；n建立含建立含特殊基因型特殊基因型、适用于双杂交体分析适用于双杂交体分析的酵母菌株的酵母菌株84教育教学85教育教学酵母双杂交技术的基本原理酵母
32、双杂交技术的基本原理86教育教学主要特点和优势主要特点和优势n使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型和基因型相联系n筛选筛选cDNA文库文库n真实反应体内蛋白质间相互作用情况真实反应体内蛋白质间相互作用情况n不需分离靶蛋白不需分离靶蛋白n敏感性高敏感性高 87教育教学缺缺 点点1.1.假阳性结果假阳性结果 2.2.假阳性结果假阳性结果 3.3.限于核内表达的蛋白质的相互作用限于核内表达的蛋白质的相互作用 88教育教学 2基于质谱的蛋白质相互作用研究方法基于质谱的蛋白质相互作用研究方法n靶蛋白制备靶蛋白制备n蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化n蛋白质蛋白质复合体复合体的质谱鉴定的质谱鉴定
33、基本步骤：基本步骤：89教育教学（1）亲和层析耦联质谱技术）亲和层析耦联质谱技术 n基本原理：基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结）鉴定靶蛋白的结合蛋白。合蛋白。90教育教学先
34、决条件先决条件 n得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（白作为诱饵（bait） n获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质的蛋白质 91教育教学主要优点主要优点 n灵敏度高：高浓度靶蛋白灵敏度高：高浓度靶蛋白 n候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等n检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用92教育教学（2）免疫共沉淀耦联质谱技术）免疫共沉淀耦联质谱技术 n原理：原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀白抗体
35、与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白纯化靶蛋白免疫复合物免疫复合物，凝胶电泳分离后凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。蛋白的结合蛋白。93教育教学研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白n抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀总蛋白进行免疫共沉淀nSDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物n切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签）分析，得到相应的肽序列标签 n搜
36、索数据库搜索数据库 94教育教学特特 点点 生理条件下蛋白质之间的相互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 95教育教学局局 限限 性性A. 灵敏性不高灵敏性不高 B. 假阳性假阳性C. 受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 96教育教学（3）串联亲和纯化耦联质谱技术）串联亲和纯化耦联质谱技术 n基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（TAP Tag），经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行
37、鉴定。97教育教学主要流程主要流程 双重分子标签构建到靶蛋白双重分子标签构建到靶蛋白 表达融合蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液制备细胞裂解液 IgG柱纯化柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体 98教育教学 耦联钙调素的亲和柱纯化耦联钙调素的亲和柱纯化 洗脱洗脱 含含EGTA的洗脱液洗脱的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质质谱鉴定结合蛋白质 续：续：99教育教学特特 点点n获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质白质 n鉴定出在空间上非直接物理相互作用的鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质蛋白质n适用于大规模蛋白质相互作用研究
38、适用于大规模蛋白质相互作用研究 100教育教学基基本本原原理理：将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行定性和定量分析。行定性和定量分析。3. 蛋白质芯片蛋白质芯片（protein chips，protein array）技术技术101教育教学依据的杂交反应原理依据的杂交反应原理: n抗原抗原-抗体反应抗体反应n配体配体-受体反应受体反应n蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用102教育教学
