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1、 第二讲第二讲 观察标本的处理观察标本的处理 切片法：切片法： 即用刀片将观察标本切成薄片。即用刀片将观察标本切成薄片。A.优点优点：观察标本组织间的各种构造，仍能保观察标本组织间的各种构造，仍能保持正常的相互关系。持正常的相互关系。B.缺点缺点：在一个切片上就不能看到整个组织外在一个切片上就不能看到整个组织外貌。貌。分散法：分散法： 即用化学的或物理的方法，将观察标本即用化学的或物理的方法，将观察标本分离成单个细胞或薄片，或者将整个观察标分离成单个细胞或薄片，或者将整个观察标本进行整体封藏。本进行整体封藏。优点优点仍能保持每个小单位的完整。仍能保持每个小单位的完整。缺点缺点彼此间相互的关系（
2、除整体封藏外）彼此间相互的关系（除整体封藏外）就不一定看得清楚了。就不一定看得清楚了。第一节第一节 整体及局部特征制片整体及局部特征制片第二节第二节 扫描电镜观察标本简介扫描电镜观察标本简介 第一节第一节 整体及局部特征制片整体及局部特征制片 一、昆虫整体封片一、昆虫整体封片 二、昆虫软组织制片技术二、昆虫软组织制片技术 一、昆虫整体封片一、昆虫整体封片（一）昆虫胚卵整体封片（一）昆虫胚卵整体封片 （二）昆虫局部器官的整封片（二）昆虫局部器官的整封片（一）昆虫胚卵整体封片（一）昆虫胚卵整体封片 1.固定、解剖：固定、解剖：将将布安氏液布安氏液(苦味酸、冰醋酸和甲醛以一定苦味酸、冰醋酸和甲醛以一
3、定比例配制）比例配制）固定好的卵粒放入蜡盘，注入固定好的卵粒放入蜡盘，注入70%酒精酒精，在，在实体镜下用尖嘴无齿摄及解剖针撕开卵壳，取出完整的实体镜下用尖嘴无齿摄及解剖针撕开卵壳，取出完整的卵胚，放入装有卵胚，放入装有70%酒精的小瓶中。酒精的小瓶中。2.染色染色：用吸管吸去：用吸管吸去70%酒精，加数滴酒精，加数滴硼砂洋红硼砂洋红浸没标本，浸没标本，染色染色5-10分钟。分钟。3.脱水、透明脱水、透明：用：用70%酒精洗涤酒精洗涤2-3次，再经次，再经80%、90%、100%酒精逐级脱水酒精逐级脱水30分钟。然后用分钟。然后用二甲苯透明二甲苯透明2小时小时。（一）昆虫胚卵整体封片（一）昆虫
4、胚卵整体封片4.封片封片：载玻片上滴上粘稠的树脂，把已透明好的胚：载玻片上滴上粘稠的树脂，把已透明好的胚胎放在树脂内，摆好位置。做好的整封片水平放置胎放在树脂内，摆好位置。做好的整封片水平放置在在30恒温箱中，恒温箱中，3一一4周后，待树脂充分凝固即可周后，待树脂充分凝固即可装盒。装盒。（二）昆虫局部器官的整封片（二）昆虫局部器官的整封片（气门）1.1.固定固定：在实体镜下，取昆虫气门一对，投入：在实体镜下，取昆虫气门一对，投入70%70%酒精内酒精内固定固定1 1小时。小时。2.2.染色染色：用吸管吸去固定液，滴入：用吸管吸去固定液，滴入硼砂洋红染色硼砂洋红染色5 5分钟分钟，吸去染色液后，
5、用吸去染色液后，用70%70%酒精洗涤几次。酒精洗涤几次。3.3.脱水、透明及封片：脱水、透明及封片：经经80%80%、90%90%、95%95%酒精逐级脱水酒精逐级脱水1515分钟分钟，用，用100%100%酒精脱水两次，每次酒精脱水两次，每次1010分钟，用分钟，用100%100%酒酒精和二甲苯等量混合液处理精和二甲苯等量混合液处理3030分钟，转入分钟，转入二甲苯液中二甲苯液中透明透明3030分钟分钟至至1 1小时即可用中性树胶封藏。小时即可用中性树胶封藏。 二、昆虫软组织制片技术二、昆虫软组织制片技术 （一）涂抹制片（一）涂抹制片 （二）压碎制片（二）压碎制片 （三）离散制片（三）离散
6、制片（一）涂抹制片（血液涂片）（一）涂抹制片（血液涂片） 1.1.取血液：取血液：用左手持住经用左手持住经乙醚乙醚麻醉的虫体，右手持昆虫针麻醉的虫体，右手持昆虫针刺破幼虫的腹足基部，迅速将伤口流出的血液滴在洗净刺破幼虫的腹足基部，迅速将伤口流出的血液滴在洗净的载玻片上。的载玻片上。2.2.涂片涂片：左手持血液载玻片，右手持另一个载玻片，以其：左手持血液载玻片，右手持另一个载玻片，以其一端边缘置于血液的左侧。右手将玻片稍向后拉，血液一端边缘置于血液的左侧。右手将玻片稍向后拉，血液立即充满在两玻片的斜角中，再以立即充满在两玻片的斜角中，再以30-4030-40度斜角向左均匀度斜角向左均匀推过去，即
7、涂成血液薄膜玻片。推过去，即涂成血液薄膜玻片。3.3.固定、染色及封片：固定、染色及封片：涂片稍稍晾干，滴涂片稍稍晾干，滴甲醇甲醇数滴以覆盖数滴以覆盖血膜，固定血膜，固定3 3分钟。用吸水纸吸去甲醇液，滴上数滴分钟。用吸水纸吸去甲醇液，滴上数滴10%10%吉姆萨染液吉姆萨染液，染色，染色1010一一3030分钟或更长。染色后用分钟或更长。染色后用磷酸缓磷酸缓冲液分色冲液分色，至着色清晰为度，然后晾干涂片即可封藏。，至着色清晰为度，然后晾干涂片即可封藏。 （二）压碎制片（二）压碎制片 -双翅目幼虫唾液腺的染色体的制片双翅目幼虫唾液腺的染色体的制片1.1.取出唾液腺取出唾液腺：挑出三龄老熟幼虫放入
8、：挑出三龄老熟幼虫放入生理盐水生理盐水中。左中。左手持尖嘴无齿镊，捏住幼虫尾部约手持尖嘴无齿镊，捏住幼虫尾部约1/31/3处，右手持解剖处，右手持解剖针用平稳的力量向右移动，将幼虫的头节拉开可见唾针用平稳的力量向右移动，将幼虫的头节拉开可见唾液腺。液腺。2.2.解离解离：将唾液腺放入：将唾液腺放入盐酸盐酸溶液中处理溶液中处理5 5一一8 8分钟，使腺分钟，使腺体细胞分离，然后用吸水纸吸去盐酸溶液。然后用蒸体细胞分离，然后用吸水纸吸去盐酸溶液。然后用蒸馏水滴洗馏水滴洗2-32-3次。次。3.3.染色染色：用：用石炭酸品红染液石炭酸品红染液，染色，染色15-2015-20分钟，即可在低分钟，即可在
9、低倍显微镜下观察核内染色体被染成紫红色，细胞质为倍显微镜下观察核内染色体被染成紫红色，细胞质为浅红色。浅红色。（二）压碎制片（二）压碎制片4 4。染色体释放。染色体释放：将盖玻片压盖于腺体上，随即用解剖：将盖玻片压盖于腺体上，随即用解剖针轻轻按压盖玻片，染色体便成串地从破裂处分散针轻轻按压盖玻片，染色体便成串地从破裂处分散到腺体周围。再以拇指对着盖玻片垂直地压一下，到腺体周围。再以拇指对着盖玻片垂直地压一下，既吸去多余的染液，又使染色体的形态及位置固定既吸去多余的染液，又使染色体的形态及位置固定下来。下来。5.5.镜检镜检：取出载玻片与盖玻片分别在低倍镜下检查。取出载玻片与盖玻片分别在低倍镜下
10、检查。6.6.脱水、透明及封片脱水、透明及封片：将载玻片和盖玻片分别经将载玻片和盖玻片分别经95%95%、100%100%和和100%100%三个洒精皿中停留三个洒精皿中停留1-21-2分钟，然后再分分钟，然后再分别经两个二甲苯皿中透明别经两个二甲苯皿中透明5 5分钟，即可用中性树胶分钟，即可用中性树胶封藏。封藏。（三）离散制片（肌肉制片）（三）离散制片（肌肉制片） 1.1.解剖蜜蜂，取出肌肉用解剖蜜蜂，取出肌肉用FAAFAA固定液固定液( (甲醇甲醇5ml5ml，冰醋酸冰醋酸5ml5ml和和70%70%酒精酒精90ml90ml配合而成配合而成) )固定固定2424小时。然后经小时。然后经50
11、%50%、30%30%酒精和蒸馏酒精和蒸馏水各水各1-21-2小时，并多次用蒸馏水洗涤。小时，并多次用蒸馏水洗涤。2.2.用用马克凯郎氏液马克凯郎氏液( (硝酸硝酸10ml,10ml,甘油甘油20ml20ml和蒸馏水和蒸馏水20ml20ml配成配成) )浸泡浸泡2 2天。经多次蒸馏水洗涤，将组织块置于载玻片上，盖上盖玻天。经多次蒸馏水洗涤，将组织块置于载玻片上，盖上盖玻片，轻压并稍转动使组织块分散。片，轻压并稍转动使组织块分散。3.3.将分散后的极小组织块加入将分散后的极小组织块加入OrthOrth锂卡红锂卡红（碳酸锂饱和水溶液（碳酸锂饱和水溶液100ml100ml和洋红和洋红3-5g,3-5
12、g,煮沸煮沸l5l5分钟分钟, ,冷却后过滤配成）染色冷却后过滤配成）染色2020分钟。分钟。然后吸去染液，然后吸去染液，70%70%酒精洗涤几次，再用蒸馏水洗涤数次酒精洗涤几次，再用蒸馏水洗涤数次。（三）离散制片（三）离散制片4.4.将组织块放入蒸馏水中，用注射器抽吸冲击使之分散成单将组织块放入蒸馏水中，用注射器抽吸冲击使之分散成单个细胞，取上部的悬浮液（内含单一肌纤维）迅速倒入另个细胞，取上部的悬浮液（内含单一肌纤维）迅速倒入另一瓶中。一瓶中。5.5.悬浮液自然沉淀后，吸去上清液，经悬浮液自然沉淀后，吸去上清液，经15%15%、30%30%、50%50%、70%70%、80%80%、95%
13、95%、100%100%各级酒精脱水各级酒精脱水5-65-6小时，然后放入冬青油小时，然后放入冬青油和和100%100%酒精的等量混合液中经酒精的等量混合液中经2424小时，再用纯冬青油透明。小时，再用纯冬青油透明。6.6.用吸管吸出单个肌纤维滴入蒸发皿中，加入适量的中性树用吸管吸出单个肌纤维滴入蒸发皿中，加入适量的中性树胶，搅拌均匀后，滴一滴在载玻片，盖上盖玻片封片即成。胶，搅拌均匀后，滴一滴在载玻片，盖上盖玻片封片即成。 第二节第二节 扫描电镜观察标本简介扫描电镜观察标本简介 扫描电镜（扫描电镜（SEMSEM）是利用高能微束电子针是利用高能微束电子针（电子流）轰击样品表面，使之发出多种信号
14、（电子流）轰击样品表面，使之发出多种信号, ,再收集其中某种或某些信号加以处理放大而成再收集其中某种或某些信号加以处理放大而成像的。像的。 观察标本制备的一般程序：观察标本制备的一般程序： 取样取样 清洗清洗 固定固定 洗净洗净 脱水脱水( (逐级进行逐级进行) ) 干燥干燥 喷镀（导电处喷镀（导电处理）。现以昆虫表面形态特征的观察标本制备理）。现以昆虫表面形态特征的观察标本制备为例说明其制备过程。为例说明其制备过程。昆虫表面形态特征标本制备操作步骤昆虫表面形态特征标本制备操作步骤：1.1.取昆虫材料以取昆虫材料以0.01mol0.01mol磷酸缓冲液洗净，如被覆有磷酸缓冲液洗净，如被覆有蜡质
15、或粉末，则以二甲苯去除蜡或粉末以求尽量显蜡质或粉末，则以二甲苯去除蜡或粉末以求尽量显示其表面形态特征；示其表面形态特征；2.2.固定，用固定，用10%10%的戊二醛予以固定的戊二醛予以固定1 1小时；小时；3.3.洗净，以洗净，以0.1mol0.1mol磷酸缓冲液漂洗磷酸缓冲液漂洗2-32-3次；次；4.4.再将样品放入再将样品放入1%1%锇酸固定液中固定锇酸固定液中固定2 2小时左右，再小时左右，再洗净，磷酸缓冲浓反复漂洗，洗净锇酸；洗净，磷酸缓冲浓反复漂洗，洗净锇酸；5.5.逐次丙酮脱水；逐次丙酮脱水；6.6.自然干燥或临界点干燥；自然干燥或临界点干燥；7.7.喷涂，在高真空中以大电流、低电压、加热喷涂金喷涂，在高真空中以大电流、低电压、加热喷涂金属，使之以原态高速蒸发出来而喷涂于样品表面，属，使之以原态高速蒸发出来而喷涂于样品表面，形成厚形成厚100-200A100-200A的金膜，借此导电。的金膜，借此导电。8.8.喷涂后即可观察喷涂后即可观察。
