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1、会计学1扫描电镜样品扫描电镜样品(yngpn)制备制备第一页，共16页。扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察(gunch)样品的表面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。第1页/共15页第二页，共16页。一、扫描电镜工作原理：主要是利用样品表面产生的二次电子成像来对物质的表面结构进行研究，是探索微观世界的有力工具。主要优点：景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种( zhn)形貌特征。第2页/共15页第三页，共16页。二、实验二、实验二、实验二、实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)用品用品用
2、品用品 材料材料 植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。 2. 2. 试剂试剂 丙酮、乙醇、丙酮、乙醇、2 2戊二醛溶液、戊二醛溶液、1 1锇酸、锇酸、0.1mol/L PH7.20.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导电胶等。二氧化碳、导电胶等。 3. 3. 器材器材 扫描电镜、扫描电镜、 临界点干燥法、真空临界点干燥法、真空(zhnkng)(zhnkng)喷镀仪、青霉素小瓶、培养皿、载玻喷镀仪、青霉素小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉等。片、牙签、脱脂棉等。第3页/共15页第四页，共16页。三、扫描电镜样
3、品三、扫描电镜样品(yngpn)(yngpn)的制备的制备第4页/共15页第五页，共16页。 取样：取样：取样：取样： 将取下的动植物组织放入预冷的含有将取下的动植物组织放入预冷的含有将取下的动植物组织放入预冷的含有将取下的动植物组织放入预冷的含有2 2 2 2戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4mm4mm4mm4mm左右、高左右、高左右、高左右、高3mm3mm3mm3mm左右的小块。左右的小块。左右的小块。左右的小块。 2.2.2.2.样品的清洁：样品的清洁：
4、样品的清洁：样品的清洁： 把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个拨入盛有逐个拨入盛有逐个拨入盛有逐个拨入盛有0.1mol/LPH7.20.1mol/LPH7.20.1mol/LPH7.20.1mol/LPH7.2磷酸缓冲液的青霉素磷酸缓冲液的青霉素磷酸缓冲液的青霉素磷酸缓冲液的青霉素小瓶中漂洗，并反复小瓶中漂洗，并反复小瓶中漂洗，并反复小瓶中漂洗，并反复(fnf)(fnf)(fnf)(fnf)更换用于清洗的缓冲液，更换用于清洗的缓冲液，更换用于清洗的缓冲液，更换用于清洗的缓冲液，一般漂
5、洗一般漂洗一般漂洗一般漂洗1 1 1 1小时，换液小时，换液小时，换液小时，换液3-43-43-43-4次。次。次。次。第5页/共15页第六页，共16页。3. 3. 样品的固定样品的固定样品的固定样品的固定 样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂(shj)(shj)和方和方和方和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表
6、面，主要是要求保持样品表面的原貌，因的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有不同之处。不同之处。不同之处。不同之处。 一般在一般在一般在一般在4 4的条件下完成固定比较好，的条件下完成固定比较好，的条件下完成固定比较好，的条件下完成固定比较好， 戊二醛、锇酸均戊二醛、锇酸均戊二醛、锇酸均戊二醛、锇酸均可
7、单独固定，也可用可单独固定，也可用可单独固定，也可用可单独固定，也可用“ “戊二醛戊二醛戊二醛戊二醛- -锇酸锇酸锇酸锇酸” ”双重固定法。双重固定法。双重固定法。双重固定法。 固定固定固定固定1-31-3小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定液，液，液，液， 加入加入加入加入0.1mol/L PH7.20.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液，漂洗磷酸缓冲液，漂洗磷酸缓冲液，漂洗磷酸缓冲液，漂洗1 1小时，换小时，换小时，换小时，换液液液液3-43-4次。次。次。次
8、。第6页/共15页第七页，共16页。4. 4. 脱水脱水脱水脱水 从小瓶中吸出缓冲液，从小瓶中吸出缓冲液，从小瓶中吸出缓冲液，从小瓶中吸出缓冲液， 加入乙醇逐级梯度加入乙醇逐级梯度加入乙醇逐级梯度加入乙醇逐级梯度(t d)(t d)脱水，脱水，脱水，脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为脱水剂的乙醇浓度依次为脱水剂的乙醇浓度依次为脱水剂的乙醇浓度依次为30%30%50%50%70%70%80%80%90%90%100%100%乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停留留留留15-3015-30分钟。分钟。分钟
9、。分钟。5. 5. 置换乙醇置换乙醇置换乙醇置换乙醇 吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1 1：1 1的混合液，浸的混合液，浸的混合液，浸的混合液，浸泡泡泡泡10-2010-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋酸异戊酯浸泡酸异戊酯浸泡酸异戊酯浸泡酸异戊酯浸泡10-2010-20分钟并适当摇动。分钟并适当摇动。分钟并适当摇动。分钟并适当摇动。6. 6. 样品的干燥样品的干燥样品的干燥样品的干燥
10、 常规临界点干燥法。常规临界点干燥法。常规临界点干燥法。常规临界点干燥法。第7页/共15页第八页，共16页。临界点干燥临界点干燥临界点干燥临界点干燥(gnzo)(gnzo)(gnzo)(gnzo)法法法法n n临界点干燥法是一种消除了物相界面临界点干燥法是一种消除了物相界面( (液相气相液相气相) )，也就是消除了，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如下：以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如下： n n装样：装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入将样品从醋酸异戊酯中挑入(
11、(或倒入或倒入) )样品笼中，用滤纸吸去样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯( (高压容器高压容器) )内，盖上盖并拧紧以防漏气。内，盖上盖并拧紧以防漏气。( (注：在装样前，应先打开仪器电源，注：在装样前，应先打开仪器电源，将温度调节将温度调节(tioji)(tioji)设定在设定在00处预冷处预冷101015min15min，以保证液态二氧，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中化碳有足够量进入样品杯中) )。 n n注入液体二氧化碳注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的进气阀在依次打开二氧化碳钢
12、瓶排气阀和仪器的进气阀在0 01010下，向样品杯注入液体二氧化碳。下，向样品杯注入液体二氧化碳。 n n当液体二氧化碳充至样品杯容积的当液体二氧化碳充至样品杯容积的5050( (通过刻度尺观察，以液面超通过刻度尺观察，以液面超过样品笼为度过样品笼为度) )时，关闭仪器进气阀，静置时，关闭仪器进气阀，静置151520min20min，让醋酸异戊，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液进气阀门，让其边排气边充液10min10min左右，左右，( (让含有醋酸异戊酯的二让含有醋酸异戊酯
13、的二氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳) )再关闭排气阀；继续充入液再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳至样品杯的体二氧化碳至样品杯的8080左右，关闭进液阀，停止充液。左右，关闭进液阀，停止充液。 第8页/共15页第九页，共16页。n n加温置换：将温度调节设定在加温置换：将温度调节设定在2020处经处经151520min20min后，由于温度后，由于温度升高，杯内液体升高，杯内液体(yt)(yt)二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至上升至7000Pa7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置左右，样品中的醋酸
14、异戊酯将与二氧化碳充分置换。换。 n n气化：将温度旋钮调至临界温度以上气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35(3540)40)，此时随着温，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到界面也随之消失。当压力达到7134Pa7134Pa时，经时，经5min5min后，即可排气。后，即可排气。 n n排气：在保持温度不变的条件下排气：在保持温度不变的条件下( (即不关电源即不关电源) )，打开流量计的，打开流量计的排气阀门，以排气阀门，以1.01.01.511.51minmin的速度排气的速度
15、排气( (速度慢些更好速度慢些更好) )。约。约经经454560min60min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约节至室温约5rain5rain后，即可取出样品装台镀膜后，即可取出样品装台镀膜( (若不能立即装台，若不能立即装台，应置于干燥器内保存应置于干燥器内保存) )。 第9页/共15页第十页，共16页。临界点干燥操作时的注意事项：临界点干燥操作时的注意事项：临界点干燥操作时的注意事项：临界点干燥操作时的注意事项： 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却在样
16、品放进样品杯前，样品杯应预先冷却(lngqu)(lngqu)(lngqu)(lngqu)至至至至0 0 0 010101010。样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过
17、干又会因空气干燥而造成样品己变戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。形，再进行临介点干燥也没有意义了。形，再进行临介点干燥也没有意义了。形，再进行临介点干燥也没有意义了。 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不
18、足而达不到临界点。完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容
19、积的2/32/32/32/3左右。左右。左右。左右。 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。界状态。界状态。界状态。 开开开开 、 闭闭闭闭 阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜突然冲击而
20、造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在4Omin4Omin4Omin4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中午。以上，有时也可以放气过夜或过中午。以上，有时也可以放气过夜或过中午。以上，有时也可以放气过夜或过中午。 第10页/共15页第十一页，共16页。7. 7. 粘贴样品粘贴样品粘贴
21、样品粘贴样品 用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品底面。用用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品底面。用用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品底面。用用牙签将少量导电胶涂到样品台上，胶面应略小于样品底面。用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在涂胶上。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和电胶干透，才能进行真空镀膜和电胶干透，才能进行真空镀膜和电胶干透，才能进行真空镀膜和SEMSEM镜检。
22、镜检。镜检。镜检。8. 8. 样品的导电处理样品的导电处理样品的导电处理样品的导电处理 生物样品和其他非金属样品的表面生物样品和其他非金属样品的表面生物样品和其他非金属样品的表面生物样品和其他非金属样品的表面(biomin)(biomin)电阻率很高，在电电阻率很高，在电电阻率很高，在电电阻率很高，在电镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号序数的
23、碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电的样品在扫描电镜观察前，均需进行象的产生，生物样品和非导电的样品在扫描电镜观察前，均需进行象的产生，生物样品和非导电的样品在扫描电镜观察前，均需进行象的产生，生物样品和非导电
24、的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面表面表面表面(biomin)(biomin)导电处理。扫描电镀样品的表面导电处理。扫描电镀样品的表面导电处理。扫描电镀样品的表面导电处理。扫描电镀样品的表面(biomin)(biomin)导电处导电处导电处导电处理方法，主要有金属镀膜法和组织导电处理法两种。其中金属镀膜理方法，主要有金属镀膜法和组织导电处理法两种。其中金属镀膜理方法，主要有金属镀膜法和组织导电处理法两种。其中金属镀膜理方法，主要有金属镀膜法和组织导电处理法两种。其中金属镀膜法又有真空镀膜及离子溅射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀法又有真空镀膜及离子溅射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀法又
25、有真空镀膜及离子溅射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀法又有真空镀膜及离子溅射镀膜法等方法，本实验采用离子溅射镀膜法进行镀膜。膜法进行镀膜。膜法进行镀膜。膜法进行镀膜。 第11页/共15页第十二页，共16页。离子离子离子离子(lz)(lz)(lz)(lz)溅射镀膜法溅射镀膜法溅射镀膜法溅射镀膜法: : : : 在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金属在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行金属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很简单，镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜
26、法的装置很简单，主要由真空部分主要由真空部分( (真空泵真空泵) )和溅射部分和溅射部分( (真空罩真空罩) )组成，在真空组成，在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面(y min)(y min)装有用装有用于溅射用的金属靶于溅射用的金属靶( (黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等) )，样品，样品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10101Pa1Pa时，在阴极与阳极之间加上时，在阴极与阳极之间加上100010003000V3000V的直流电压，两极的直流电压，两极之间产生弧光
27、放电的电场。在电场的作用下，罩内残余的气之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着在样品表面靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着在样品表面而形成金属导电膜。而形成金属导电膜。 第12页/共15页第十三页，共16页。离子溅射镀膜法操作注意事项：离子溅射镀膜法操作注意事项： 样品要充分干燥，否则，金属颗粒不但不能附着，反而会引起样品损伤，样品要充分干燥，否则，金属颗粒不但不能附着，反而会引起样品损伤，特别是能放出有机气体的样品，有机气体会
28、因放电特别是能放出有机气体的样品，有机气体会因放电(fng din)(fng din)而分而分解，使样品引起碳化污染。解，使样品引起碳化污染。 加高压时辉光放电加高压时辉光放电(fng din)(fng din)的颜色应为蓝色或紫蓝色，若是红色，应的颜色应为蓝色或紫蓝色，若是红色，应立即停止加高压，继续抽气。立即停止加高压，继续抽气。 加高压后，若真空度下降幅度较大，应立即停止镀膜，待充分抽气后再加高压后，若真空度下降幅度较大，应立即停止镀膜，待充分抽气后再继续镀膜。继续镀膜。 第13页/共15页第十四页，共16页。一些一些一些一些(yxi)(yxi)(yxi)(yxi)电镜图片电镜图片电镜图片电镜图片染色体 染色体 被精子(jngz)包围的卵子骨髓细胞 SARS AIDS第14页/共15页第十五页，共16页。内容(nirng)总结会计学。继续充入液体二氧化碳至样品杯的80左右，关闭进液阀，停止充液。在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。粘贴后，待导电胶干透，才能进行真空镀膜和SEM镜检。在低真空中进行辉光放电(fng din)时，由于离子冲击，阴极金属物质有飞溅现象称为溅射。一些电镜图片第十六页，共16页。
