食品理化检验 维生素的测定

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1、Determination of Vitamin in Food一、概述一、概述 二、脂溶性二、脂溶性维生素的生素的测定（重点、定（重点、难点）点） 三、水溶性三、水溶性维生素的生素的测定（重点、定（重点、难点）点）（一）维生素的分类及共性（一）维生素的分类及共性（二）常见维生素的生理功能（二）常见维生素的生理功能 （三）（三） 维生素的测定意义维生素的测定意义 （一）维生素的分类（一）维生素的分类 目前已发现的维生素约有二、三十种，按目前已发现的维生素约有二、三十种，按溶溶解性解性可分为两大类：可分为两大类：脂溶性维生素：脂溶性维生素：A、D、E、K等等；水溶性维生素：水溶性维生素：B B、

2、C C等（如等（如B1、B2、B6、B12和和C等）等）维生素都具有以下共同特点：维生素都具有以下共同特点： 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在； 它它们不能供不能供给机体机体热能；也不是构成能；也不是构成组织的基本原料；的基本原料； 主要功用是通主要功用是通过作作为辅酶的成份的成份调节代代谢过程，需要量程，需要量 极小；极小； 它它们一般在体内不能合成，或合成量不能一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，足生理需要，必必须经常从食物中常从食物中摄取；取； 长期缺乏任何一种期缺乏任何一种维生素都会生素都会导致相致相应的疾病。的疾病。维生素

3、维生素A：是人体必需是人体必需营养素，能促养素，能促进人体人体发育，防止眼膜育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。炎、夜盲症等疾病。维生素维生素B B1 1：也叫硫胺素，也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促炎，帮助消化，促进发育。育。维生素维生素B B2 2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。象。维生素维生素C C：防坏血病，促防坏血病，促进外外伤愈合，使机体增愈合，使机体增强抵抗力。抵抗力。维生素维生素D D：调节体内体内矿物物盐的平衡，特的平衡，特别是是对人体内人体内钙、磷的、磷的代代谢，并能防止，并能防

4、止软骨病。骨病。 （二）常见维生素的生理功能（二）常见维生素的生理功能（三）维生素的测定意义（三）维生素的测定意义评价食品的价食品的营养价养价值；开开发利用富含利用富含维生素的食品生素的食品资源；源；指指导人人们合理合理调整膳食整膳食结构，防止构，防止维生素缺乏症；生素缺乏症；研究研究维生素在食品加工、生素在食品加工、贮存等存等过程中的程中的稳定性，指定性，指导制定制定合理的生合理的生产工工艺条件及条件及贮存条件，最大限度地保留各种存条件，最大限度地保留各种维生生素；素；监督督维生素生素强化食品的化食品的强化化剂量，防止量，防止维生素生素摄入入过多引起多引起中毒。中毒。二、脂溶性维生素的测定二

5、、脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的测定方法脂溶性维生素的测定方法 常与脂常与脂类物物质共存于食物中，共存于食物中，摄食食时一道被人一道被人体吸收。体吸收。 1.1.溶解性：溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、仿、乙乙醚、苯等有机溶、苯等有机溶剂； 2.2.耐酸碱性：耐酸碱性：维生素生素A、D对酸不酸不稳定，定，对碱碱稳定；定；维生素生素E对酸酸稳定，定，对碱不碱不稳定，但在抗氧化定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保存在下或惰性气体保护下，也能下，也能经受碱的煮受碱的煮沸。沸。（一）脂溶性维生素的主要理化性质（一

6、）脂溶性维生素的主要理化性质 3 3耐热性、耐氧化性：耐热性、耐氧化性： 耐耐热性性 氧化性氧化性VA 好，能好，能经受煮沸受煮沸 易被氧化易被氧化 （光、光、热促其氧化）促其氧化） V D 好，能好，能经受煮沸受煮沸 不易被氧化不易被氧化 V E 好，能好，能经受煮沸受煮沸 在空气中能慢慢被氧化在空气中能慢慢被氧化 （光、（光、热、碱促其氧化）、碱促其氧化） 根据上述性根据上述性质，测定脂溶性定脂溶性维生素生素时，通常：，通常：皂化皂化样品品 类脂物和脂物和维生素分开生素分开 有机溶有机溶剂提取提取脂溶性脂溶性维生素生素(不皂化物不皂化物) 浓缩 溶于适当的溶溶于适当的溶剂 测定。定。 （食

7、物中脂溶性（食物中脂溶性维生素常与脂肪共存，一道被人体吸生素常与脂肪共存，一道被人体吸收，所以要除去脂肪，防止干收，所以要除去脂肪，防止干扰。）。） 在皂化和在皂化和浓缩时，为防止防止维生素的氧化分解生素的氧化分解，常加入，常加入抗氧化抗氧化剂(如焦性没食子酸、如焦性没食子酸、维生素生素C等等)。 对于于A、D、E共存的共存的样品，或品，或杂质含量高的含量高的样品，在品，在皂化提取后，皂化提取后，还需需进行行层析分离。析分离。常用的测定方法有常用的测定方法有: 薄层色谱法、分光光度法、气相薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱法、高效液相色谱法等。高效液相色谱法：高效液相色

8、谱法：快速、高效、高灵敏度等优点，快速、高效、高灵敏度等优点， 是我国卫生标准分析方法是我国卫生标准分析方法 （二）脂溶性维生素的测定方法（二）脂溶性维生素的测定方法 食品中食品中VA和和VE的测定的测定 （GB5009.82-2003)维生素维生素A A：存在于存在于动物性脂肪中，主要来源于肝物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋干油、蛋类、乳、乳类等等动物性食品中；物性食品中；植物性食品中不合植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有，但在深色果蔬中含有胡胡萝卜素，它在人体内可卜素，它在人体内可转变为VA，故称，故称为VA原原;包括包括A1和和A2。维生素维生素E E： （第一法）（第一法）

9、HPLC测定测定VA和和VE 一、原理一、原理 食品食品样品品经皂化皂化处理理后，用后，用有机溶有机溶剂将食将食品中的品中的脂溶性脂溶性维生素生素（如（如维生素生素A A、维生素生素E E）从不可皂化的部分）从不可皂化的部分提取提取出来，出来，经过浓缩除除去有机溶去有机溶剂，再用适当的，再用适当的溶溶剂溶解溶解后，用后，用HPLCHPLC法法C C1818反相柱将反相柱将V VA A和和V VE E分离，分离，经紫外紫外检测器，器，用内用内标法法测定其含量。定其含量。 二、样品处理二、样品处理 （1 1）皂化：）皂化： 称取适量称取适量样品（含品（含VA30g,VE40g）于三角瓶中，加于三角

10、瓶中，加30mL无水乙醇，振无水乙醇，振摇使使样品分散；加入品分散；加入5mL，100g/L抗坏血酸和抗坏血酸和2mL苯并苯并e芘溶液（内芘溶液（内标）混匀，加入）混匀，加入10mL氢氧化氧化钾(1:1) ，混匀，于沸水浴上，混匀，于沸水浴上 回流回流30min，使皂化完全（若有混，使皂化完全（若有混浊现象，象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷却；冷却； （2 2）提取：）提取： 将皂化液移入分液漏斗，先用将皂化液移入分液漏斗，先用50mL50mL水分水分2 2次洗次洗涤皂化瓶（若有渣，可皂化瓶（若有渣，可经过脱脂棉脱脂棉过滤），再用），再用100mL

11、100mL无水乙无水乙醚分分2 2次洗次洗涤皂化皂化瓶及残渣，所有乙瓶及残渣，所有乙醚洗液并入分液漏斗中，洗液并入分液漏斗中，振振摇两分两分钟（注意放气），静止分（注意放气），静止分层后，后，弃去水弃去水层；然后每次用；然后每次用100mL100mL水将乙水将乙醚液洗液洗至中性，需洗至中性，需洗4-54-5次。次。 （3 3）浓缩：）浓缩： 将乙将乙醚提取液提取液经无水硫酸无水硫酸钠滤入入150mL旋旋转蒸蒸发瓶内，用瓶内，用约15mL 乙乙醚洗洗涤分液漏斗和无水硫酸分液漏斗和无水硫酸钠2次，次，洗液并入蒸洗液并入蒸发瓶中，瓶中，于于55水浴中水浴中减减压蒸蒸馏并回收乙并回收乙醚，待瓶中乙，待

12、瓶中乙醚剩余剩余约2mL时，取下蒸，取下蒸发瓶，用氮瓶，用氮气吹干乙气吹干乙醚，随即加入，随即加入2mL乙醇，乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇移充分混合、溶解提取物。将乙醇移入塑料离心管中，于离心机上离心入塑料离心管中，于离心机上离心5min，上清液供色，上清液供色谱分析用。分析用。 三、所需主要仪器三、所需主要仪器 高效液相色高效液相色谱（带紫外分光紫外分光检测器）器） 旋旋转蒸蒸发器器 高速离心机（高速离心机（带离心管）离心管） 恒温水浴恒温水浴锅 紫外分光光度紫外分光光度计说明：国明：国标中用其来中用其来标定定VA和和VE的的浓度度 四、液相色谱分析四、液相色谱分析色谱参考条件：色谱参

13、考条件：预柱：预柱：ODS 10m（4mmx4.5cm)分析柱：分析柱：ODS 5m（4.6mmx25cm)流动相：甲醇：水流动相：甲醇：水98：2，混匀，临用前脱，混匀，临用前脱气；气；紫外检测器波长：紫外检测器波长：300nm，量程，量程0.02；进样量：进样量：20L;流速：流速：1.651.70mL/min测定（1）配制）配制标准溶液准溶液VA标准溶液：准溶液：将将VA标准品用无水乙醇溶解配制成准品用无水乙醇溶解配制成浓度度为1mg/ml;VE标准溶液准溶液:用无水乙醇分用无水乙醇分别溶解溶解-生育酚、生育酚、-生育酚、生育酚、-生育酚生育酚3种种标准品，配制成准品，配制成浓度度为1m

14、g/ml的的标准液；准液；内内标溶液溶液：将苯并：将苯并e芘用无水乙醇配制成芘用无水乙醇配制成浓度度为10g/ml;（2）绘制制标准曲准曲线将一定量的将一定量的VA标准溶液、准溶液、3种种VE标准溶液和内准溶液和内标溶液混和均匀，溶液混和均匀，对其混和液其混和液进行色行色谱分析，以分析，以维生素峰面生素峰面积和内和内标物峰面物峰面积之比之比为纵坐坐标，以，以维生素生素浓度度为横坐横坐标，绘制制标准曲准曲线（直（直线回回归方方程）。程）。（3 3）样品测定）样品测定取取试样浓缩液液20l注入色注入色谱仪中，中，进行行检测；定性：定性：用用标准物色准物色谱峰的保留峰的保留时间定性；定性；定量：定量

15、：根据色根据色谱图求出某种求出某种维生素峰面生素峰面积与内与内标物峰物峰 面面积的比的比值，以此比，以此比值由回由回归方程求出方程求出维生素含量；生素含量；五、结果计算五、结果计算X：某种：某种维生素的含量，生素的含量，mg/100g：由：由标准曲准曲线上上查到的某种到的某种维生素含量，生素含量，g/mLV：样品品浓缩后定容体后定容体积,mL m：样品品质量，量，g水溶性水溶性维生素的理化性生素的理化性质维生素生素B1的的测定定维生素生素B2的的测定定维生素生素C的的测定定 三、水溶性维生素的测定三、水溶性维生素的测定 易溶于水，不溶于大部分有机溶剂；易溶于水，不溶于大部分有机溶剂； 在酸性介

16、质中稳定，在碱性条件下不在酸性介质中稳定，在碱性条件下不稳定；稳定； 易受空气、光、热、酶、金属离子的易受空气、光、热、酶、金属离子的影响。影响。 （一）水溶性维生素的主要理化性质（一）水溶性维生素的主要理化性质（二）（二）维生素生素B1的的测定定 VB1又叫硫胺素、抗神又叫硫胺素、抗神经炎素炎素 1、食品中、食品中VB1的存在形式的存在形式常以游离常以游离态存在；存在；复合脂形式存在（磷蛋白）；复合脂形式存在（磷蛋白）；辅羧酶形式存在形式存在VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，丰富，动物物组织不如

17、植物不如植物含量丰富。含量丰富。 VB1在在中性、碱性下不中性、碱性下不稳定定，易分解；，易分解； VB1在在酸性条件下酸性条件下稳定定，即使加，即使加热酸性也酸性也稳定；定； VB1为白色白色结晶，微溶于晶，微溶于C2H5OH，不溶于，不溶于乙乙醚或或CHCl3，易溶于水易溶于水。2.VB2.VB1 1的性质的性质3.维生素生素B1的的测定方法定方法 紫外分光光度法紫外分光光度法: : 适用于适用于VBVB1 1含量高的含量高的样品品, ,灵敏度和准灵敏度和准 确度确度较差差; ; 高效液相色高效液相色谱法法 适用于食品中微量适用于食品中微量VBVB1 1的的测定定 荧光法光法 世界各国都用

18、世界各国都用荧光法光法测定定; ; 荧光法光法是我国国家是我国国家标准分析方法准分析方法（GB/T 5009.84-2003GB/T 5009.84-2003） 原理：原理： 硫胺素硫胺素在碱性在碱性铁氰化化钾溶液中，溶液中，被氧化被氧化成成一种一种兰色色荧光物光物质，即，即为硫色素硫色素，在，在紫紫外光外光下，下，硫色素硫色素发出出荧光光，在一定条件下，在一定条件下，其其荧光光强度与硫色素度与硫色素浓度成正比度成正比，即与硫，即与硫胺素含量成正比。胺素含量成正比。v（2）定量方法）定量方法标准曲准曲线法：法： 配配制制一一系系列列标准准浓度度试样测定定荧光光强度度，绘制制标准准曲曲线，再再在

19、在相相同同条条件件下下测量量未未知知试样的的荧光光强度，在度，在标准曲准曲线上求出上求出浓度。度。(3). 操作步操作步骤 试样处理 样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。 提取 1) 水解 2) 酶解称样三角瓶三角瓶高高压水解水解盐酸溶液酸溶液调pHpH值乙酸乙酸钠溶液溶液酶解解淀粉淀粉酶定容定容 吸附吸附剂采用的是采用的是人造浮石人造浮石。将将提提取取液液加加入入人人造造浮浮石石交交换柱柱中中，VB1VB1被被吸吸附附上上去去，吸吸附附上上去去后后，再再用用热水水淋淋洗洗，洗洗去去杂质，最最后后用用热的的酸酸性性氯化化钾（25%KCl-HAC25%KCl-HAC）把把VB1VB1洗脱下来

20、，洗脱下来，这样就得到就得到纯VB1VB1。样品品热水水酸性酸性氯化化钾收集酸性收集酸性氯化化钾定容定容 净化净化 氧化氧化 静置静置 过滤 脱水脱水反应瓶编号反应瓶编号标准标准A A瓶瓶标准标准B B瓶瓶样品样品A A瓶瓶样品样品B B瓶瓶加标准液或加标准液或样品液样品液标准液标准液5ml5ml 标准液标准液5ml5ml 样品液样品液5ml5ml 样品液样品液5ml5ml加氢氧化钠加氢氧化钠3ml3ml3ml3ml加碱性铁氰加碱性铁氰化钾化钾3ml3ml3ml3ml加正丁醇加正丁醇10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml 荧光光强度度测定定(通通过荧光分光光度光分光光

21、度计可以可以测得得) 激发波长激发波长365nm365nm；发射波长；发射波长435nm435nm； 激发波狭缝激发波狭缝5nm5nm；发射波狭缝；发射波狭缝5nm5nm。（4 4）方法说明）方法说明 本方法适用于各本方法适用于各类食物中硫胺素的食物中硫胺素的测定，但定，但不适用于不适用于有有吸附吸附硫胺素能力的物硫胺素能力的物质和含有影响硫色素和含有影响硫色素荧光物光物质的的样品品； 酸解、水解的目的：酸解、水解的目的：使使结合型的合型的VB1成成为游离型的游离型的； 紫外紫外线会破坏硫色素，所以硫色素形成后，会破坏硫色素，所以硫色素形成后，反反应瓶瓶要用要用黑布黑布遮盖或在暗室中遮盖或在暗

22、室中进行行荧光光测定定，并且要，并且要迅速迅速测定定； 维生素生素B2又称核黄素又称核黄素测定方法主要有：定方法主要有： 微生物法、微生物法、荧光法、光法、HPLC法法 GB/T 5009.85-2003 荧光法（第一法）光法（第一法） 微生物法（第二法）微生物法（第二法）（三）维生素（三）维生素B2的测定的测定荧光法光法测维生素生素B21.原理原理 核黄素在核黄素在440500nm波波长光照射下光照射下发生黄生黄绿色色荧光。在光。在稀溶液中其稀溶液中其荧光光强度与核黄素的度与核黄素的浓度成正比。在波度成正比。在波长525nm下下测定其定其荧光光强度。度。试液再液再加入低加入低亚硫酸硫酸钠(N

23、a2S2O4)，将，将核黄素核黄素还原原为无无荧光的物光的物质，然后再，然后再测定定试液液中残余中残余荧光光杂质的的荧光光强度，两者之差即度，两者之差即为食品中核黄素所食品中核黄素所产生的生的荧光光强度。度。 为使使VB2游离出来，采用需游离出来，采用需经酸解和酸解和酶解解 为消除干消除干扰，试样通通过氧化氧化处理和柱理和柱层析析处理。理。2.测定步定步骤（1）样品提取品提取称样三角瓶三角瓶高高压水解水解盐酸溶液酸溶液调pHpH值氢氧化氧化钠溶液溶液酶解解淀粉淀粉酶定容定容蛋白蛋白酶（2）氧化去）氧化去杂样品提取液品提取液具塞具塞试管管水水双氧水双氧水冰乙酸冰乙酸高高锰酸酸钾氧化去氧化去杂褪色

24、褪色标准液按相同方法准液按相同方法进行行（3）柱）柱层析析样品液品液水水丙丙酮- -乙酸乙酸- -水混合液水混合液水水收集洗脱液收集洗脱液定容定容 * *标准液按相准液按相同操作同操作进行行（4）荧光光测定定激激发光波光波长440nm，发射光波射光波长525nm，测量量样品管及品管及标准管的准管的荧光光值。 待待样品及品及标准的准的荧光光值测量后，在各管的剩余量后，在各管的剩余液中加液中加0.1mL 20%低低亚硫酸硫酸钠溶液，立即混匀，溶液，立即混匀，在在20s内内测出各管的出各管的荧光光值，作，作为各自的各自的空白空白值。3.3.计算计算X X：样品中核黄素含量，：样品中核黄素含量，mg/

25、100gmg/100gA A：试样荧光值：试样荧光值B B：试样空白荧光值：试样空白荧光值C C：标准荧光值：标准荧光值D D：标准空白荧光值：标准空白荧光值m m：样品质量，：样品质量，g gm m1 1：标准管中核黄素含量：标准管中核黄素含量ggf f：稀释倍数：稀释倍数100/1000100/1000：样品核黄素含量的换算系数：样品核黄素含量的换算系数维生素生素C是一种已糖是一种已糖醛基酸，有抗坏血病基酸，有抗坏血病的作用，所以被人的作用，所以被人们称做称做抗坏血酸抗坏血酸;广泛存在于广泛存在于植物组织中植物组织中，新鲜的水果、蔬菜新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子

26、叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂又是一种抗氧化剂。 （三）维生素（三）维生素C的测定的测定维生素维生素C C具有较强的还原性，对光敏感，具有较强的还原性，对光敏感，氧化后氧化后的产物的产物称为称为脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性；进一步，仍然具有生理活性；进一步水解水解则则生成生成2 2，3 -3 -二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸，失去生理作用。，失去生理作用。在食品中维生素在食品中维生素C C就是以就是以还原型、脱氢型和二酮古

27、乐糖还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型酸型这这3 3种形式存在的；食品分析中的所谓种形式存在的；食品分析中的所谓总抗坏血酸总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括不包括2 2，3 3 - -二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。 维生素维生素C C 的测定方法的测定方法测定维生素测定维生素C C 的方法有：的方法有：荧光法，高效液相色谱法，2，4 二硝基苯肼比色法， 2 2，6 6 二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法，等 GB/T5009.862003蔬菜、水果及其制品中蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸抗坏血酸含量含量测定方法定

28、方法第一法：第一法：荧光法光法第二法第二法：2，4二硝基苯二硝基苯肼比色法比色法（1）原理：原理： 试样试样中中还还原型抗坏血酸原型抗坏血酸经经活性炭氧化活性炭氧化为为脱脱氢氢抗坏血酸抗坏血酸后，与后，与邻邻苯二胺苯二胺反反应应生成有生成有荧荧光的光的喹喹唔啉唔啉，其，其荧荧光光强强度与抗坏血酸的度与抗坏血酸的浓浓度度在一定条件下成正比，以此在一定条件下成正比，以此测测定食品中抗坏定食品中抗坏血酸和脱血酸和脱氢氢抗坏血酸的抗坏血酸的总总量。量。 注意：脱注意：脱氢氢抗坏血酸可与硼酸抗坏血酸可与硼酸结结合生成复合物，而不与合生成复合物，而不与邻邻苯二胺苯二胺反反应应生成生成荧荧光物光物质质，由此

29、可以消除，由此可以消除杂质杂质的干的干扰扰。（空白（空白试验试验） （第一法）荧光法（测总抗坏血酸）（第一法）荧光法（测总抗坏血酸）（2 2）试剂试剂试剂试剂：偏磷酸偏磷酸冰醋酸溶液：称取冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL冰醋冰醋酸，加水稀酸，加水稀释释至至500mL过滤过滤后，后，贮贮存于冰箱中；存于冰箱中；硫酸：硫酸：0.15mol/L偏磷酸偏磷酸乙酸乙酸硫酸溶液：称取硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀硫酸稀释释至至500mL；乙酸乙酸钠钠溶液：称取溶液：称取500g乙酸乙酸钠钠溶解并稀溶解并稀释释至至1

30、L；硼酸硼酸乙酸乙酸钠钠溶液：称取硼酸溶液：称取硼酸9g，加入，加入35mL乙酸乙酸钠钠溶液，溶液，用水稀用水稀释释至至1000mL；邻邻苯二胺溶液：称取苯二胺溶液：称取20mg邻邻苯二胺苯二胺盐盐酸酸盐盐溶于溶于100mL水水中；中；抗坏血酸抗坏血酸标标准溶液：准确称取准溶液：准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷酸抗坏血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至50mL；抗坏血酸抗坏血酸标标准使用溶液：准使用溶液：100g/mL百里酚百里酚蓝蓝指示指示剂剂(麝香草酚麝香

31、草酚蓝蓝)：变变色范色范围围pH1.2(红红)2.8(黄黄)；活性炭：取活性炭：取50g活性炭加入活性炭加入250mL10%盐盐酸，加酸，加热热至沸，减至沸，减压过滤压过滤，用蒸，用蒸馏馏水冲洗活性炭，水冲洗活性炭，检查滤检查滤液中无液中无铁铁离子离子为为止，于止，于110120烘干。烘干。（3 3）仪仪仪仪器：器：器：器：荧荧光分光光度光分光光度计计或具有或具有350nm及及430nm 波波长长的的荧荧光光计计；捣捣碎机。碎机。（4）操作步）操作步骤骤： 试样试样的制的制备备：称取称取100克克鲜样鲜样,加加100mL偏磷酸偏磷酸-乙酸溶液，乙酸溶液，倒入倒入捣捣碎机内打成匀碎机内打成匀浆浆

32、，先取少量，先取少量样样品加入品加入1滴百里酚滴百里酚蓝蓝，若若显红显红色色(pH=1.2)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至100mL；若；若显显黄色黄色(pH=2.8)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸冰醋酸硫酸硫酸溶液定容至溶液定容至100mL，定容后，定容后过滤备过滤备用。用。 测测定：定： 氧化氧化处处理：理：将上述将上述滤滤液及抗坏血酸液及抗坏血酸标标准使用液各准使用液各100ml转转入三入三角瓶中加入角瓶中加入12g活性炭振活性炭振摇摇12分分钟钟，过滤过滤。即。即试样试样氧化氧化液和液和标标准氧化液，待准氧化液，待测测定。定。各取各取10mL标准氧化液准氧化液

33、于于2个个100mL容量瓶中，分容量瓶中，分别标明明“标准准”及及“标准空白准空白”各取各取10mL试样氧化液氧化液于于2个个100mL容量瓶中，分容量瓶中，分别标明明“试样”及及“试样空白空白”于于“标准空白准空白”及及“试样空白空白”中各加中各加5mL硼酸硼酸-乙酸乙酸钠溶溶液，液，混合混合摇动15min，用水稀，用水稀释至至100mL，在，在4冰箱中放冰箱中放置置23小小时，即得，即得“标准空白准空白”溶液及溶液及“试样空白空白”溶液，溶液，备用。用。于于“试样”及及“标准准”中各加中各加5mL /L乙酸乙酸钠溶液，用水稀溶液，用水稀释至至100mL,即得即得“试样”溶液及溶液及“标准准

34、”溶液，溶液，备用。用。标准曲准曲线的制的制备： 取上述取上述“标准准”溶液（抗坏血酸含量溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和和2.0mL标准系列，取双份分准系列，取双份分别置于置于10mL带盖盖试管中，再管中，再用水用水补充至充至2.0mL。（平行。（平行2次，做次，做标准曲准曲线） 取中取中“标准空白准空白”溶液，溶液，“样品空白品空白”溶液及溶液及 “样品品”溶溶液各液各2mL，分，分别置于置于10mL带盖盖试管中。在暗室中迅速向各管中。在暗室中迅速向各试管中加入管中加入5mL邻苯二胺溶液，振苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反混合，在室温下反应35min，于激，于激发光

35、波光波长338nm、发射光波射光波长420nm处测定定荧光光强度。度。标准系列准系列荧光光强度分度分别减去减去标准空白准空白荧光光强度度为纵坐坐标，对应的抗坏血酸含量的抗坏血酸含量为横坐横坐标，绘制制标准曲准曲线或或进行相关行相关计算，其算，其直直线回回归方程供方程供计算算时使用。使用。（5）结果果计算：算：式中式中 X-试样中抗坏血酸及脱中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸抗坏血酸总含量，含量，mg/100g； c-由由标准曲准曲线查得或由回得或由回归方程算得方程算得试样溶液溶液浓度，度，g/mL m-试样的的质量，量，g； V-荧光反光反应所用所用试样体体积，mL； F-试样溶液的稀溶液的稀释倍数。倍

36、数。（第二法）（第二法）2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法1.1.原理原理 先将先将样品中的品中的还原型抗坏血酸用活性炭原型抗坏血酸用活性炭氧化氧化为脱脱氢抗坏血酸，加抗坏血酸，加2，4二硝基苯二硝基苯肼生成生成红色色脎，根据，根据脎在硫酸溶液中的含在硫酸溶液中的含量与量与总抗坏血酸含量成正比抗坏血酸含量成正比进行比色行比色测定。定。2.2.试剂试剂提取提取Vc用：用：20g/L草酸，草酸，10 g/L草酸草酸氧化氧化处理用：活性炭（理用：活性炭（经HCl处理无理无铁离子）离子）控制氧化用：控制氧化用：20g/L硫硫脲、10g/L硫硫脲显色用：色用：20g/L2，4二硝基苯二硝基苯

37、肼溶液，硫酸溶液，硫酸1mg/mL抗坏血酸抗坏血酸标准溶液准溶液3.3.主要仪器主要仪器恒温箱或恒温水浴恒温箱或恒温水浴锅紫外可紫外可见分光光度分光光度计组织捣碎机碎机4.4.操作步骤操作步骤样品中品中Vc的提取和的提取和处理理提取（提取（样品制品制备）干样：干样：样品（品（1-4g）+适量适量10 g/L草酸，磨成匀草酸，磨成匀浆，用，用10 g/L草酸定容至草酸定容至100mL容量瓶。容量瓶。过滤，得提取液。，得提取液。鲜样：鲜样：样品品+等量的等量的20 g/L草酸，草酸，捣碎成匀碎成匀浆，取，取1040g匀匀浆，用，用10 g/L草酸定容至草酸定容至100mL容量瓶。容量瓶。过滤，得，

38、得提取液。提取液。注意：不易注意：不易过滤的的样品，可离心沉淀后取上清液再品，可离心沉淀后取上清液再过滤。氧化处理氧化处理取取25mL提取液提取液+2g活性炭，振活性炭，振摇1min，过滤。要弃去初。要弃去初滤液；液；取取10mL氧化提取液氧化提取液+10mL20g/L硫硫脲；此此20mL氧化稀氧化稀释液液为待待测液，相当于把提液，相当于把提取液稀取液稀释了了2倍。倍。（2）呈色反应）呈色反应 取3支带塞试管，各加入4mL氧化稀氧化稀释液液，留一支空白，另两支各加1.0mL20g/L2，4二硝基苯肼溶液，37恒温3h。取出，空白管在室温下冷却，另两支放入冰水中冷却。空白管冷却至室温后加1.0m

39、L20g/L 2，4二硝基苯肼溶液，15min后放入冰水中冷却。在冷却中，分别向每支试管滴加5ml（9+1）硫酸，滴加完毕取出，在室温放置30min后，用1cm比色皿，以空白管调零，500nm测吸光度。 （3）制标准曲线）制标准曲线取取50mL 1mg/mL抗坏血酸抗坏血酸标准溶液，加准溶液，加2g 活性炭，振活性炭，振摇1min，过滤，弃去初，弃去初滤液，取液，取10mL滤液，加液，加5.0g硫硫脲，用，用10 g/L草酸稀草酸稀释至至500mL容量瓶中，得容量瓶中，得20ug/mL的抗坏血酸的抗坏血酸使用液；使用液；分分别取取5、10、20、25、40、50、60mL 20ug/mL的抗坏

40、的抗坏血酸使用液血酸使用液,分分别放入放入7个容量瓶中，用个容量瓶中，用10 g/L硫硫脲稀稀释定容，定容，得得标准比色系列准比色系列为：1、2、4、5、8、10、12ug/mL；按（按（2）步）步骤呈色，并呈色，并测定吸光度；定吸光度；以吸光度以吸光度为纵坐坐标，以抗坏血酸，以抗坏血酸标准比色系列准比色系列为横坐横坐标，绘标准曲准曲线。（4）计算）计算 从从标准曲准曲线查出氧化稀出氧化稀释液的液的维生素生素C的的浓度，度，g/mL 按下式按下式计算算总抗坏血酸含量：抗坏血酸含量： X:样品中抗坏血酸含量，品中抗坏血酸含量，mg/100g P:由由标准曲准曲线得得“样品氧化液品氧化液”中中总抗

41、坏血酸的抗坏血酸的浓度，度，g/mL V:试样用用1草酸溶液定容的体草酸溶液定容的体积，mL; f:样品氧化品氧化处理理过程中的稀程中的稀释倍数倍数 m:称取的称取的样品品质量，量，g 1 1、原理、原理 在中性或弱酸性条件下，在中性或弱酸性条件下，还原型抗坏血酸原型抗坏血酸可以可以还原染料原染料2，6-二二氯靛酚靛酚,该染料在酸性溶染料在酸性溶液中呈液中呈红色色(在中性或碱性溶液中呈在中性或碱性溶液中呈蓝色色)，被被还原后原后颜色消失色消失;还原型抗坏血酸原型抗坏血酸本身被本身被氧化氧化成脱成脱氢抗坏血酸抗坏血酸。在没有在没有杂质干干扰时，样品中抗坏血酸的品中抗坏血酸的含量与消耗的染料量成正比。含量与消耗的染料量成正比。 2 2，66二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法（测定还原型抗坏血酸）（测定还原型抗坏血酸） 2 2、方法说明、方法说明滴定前，滴定前，2，6-二二氯靛酚溶液靛酚溶液需要用已知需要用已知浓度的度的标准抗坏血酸溶液准抗坏血酸溶液标定定，得到，得到2，6-二二氯靛酚溶液的准确靛酚溶液的准确浓度；度；需要做空白需要做空白试验。