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1、DNA DNA 测序的原理及方法测序的原理及方法nDNA 测序的原理nDNA测序的操作过程nDNA测序实例SangerSanger法法DNADNA测序的原测序的原理理 使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列测定技术才得到广泛应用。n n22，33ddNTPddNTP与普通与普通dNTPdNTP不同之它们可以在不同之它们可以在DNADNA聚聚合酶作用下通过其合酶作用下通过其5 5 三磷酸基团掺入到正在增长三磷酸基团
2、掺入到正在增长的的DNADNA链中，但由于没有链中，但由于没有33羟基，它们不能同后续羟基，它们不能同后续的的dNTPdNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNADNA链链不可能继续延伸。不可能继续延伸。n n在在DNADNA合成反应混合物的合成反应混合物的4 4种普通种普通dNTPdNTP中加入少量的中加入少量的一种一种ddNTPddNTP后，后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始其长度取决于从用以起始DNADNA合成
3、的引物末端到出合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。现过早链终止的位置之间的距离。n n在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上.DNADNA双脱氧法测序的原理及方法双脱氧法测序的原理及方法n n点击查看相关网页双脱氧法测序的原理n n单击查看DNA测序的动画演示n nDNA Seqamit.exe常用测序方法常用测序方法n n手工测序读序长度读序长度: : 约约 300 300bpbp同同位素位素3232P, P, 3535S S标记标记结果通过人工肉眼分析结果通过人工肉眼分析n n氩离子
4、激光器测序仪读序长度: 500-700bp可见荧光 Fam, Hex, Rox, Tamra标记软件自动读序n n红外激光器测序仪读序长度: 1000-1400bp红外荧光标记软件自动读序DNA Analysis SystemsDNA Analysis SystemsIRD 800IRD 800NXNSO3+_OAbs. Max.: 787nmEm. Max: 807nmMolar Absorptivity: 200,000 m-1 cm-1Quantum Yield: 16.5%荧光标记染料种类IRD 700IRD 700NXNSO3+_Abs. Max.: 685nmEm. Max: 70
5、5nmMolar Absorptivity: 170,000 m-1 cm-1Quantum Yield: 50%Independent Independent ChannelsChannelsn nDyes are separated by 110 nmn nDetector filters eliminate signal crossovern nLasers excite only one dye at a timeContrast to 4 Contrast to 4 colorscolorsn nNo software interpretation of dye spectrauuW
6、ith 4 colors it is difficult to distinguish between a strong signal in one color or a weak signal in a second colorn nNo dye mobility shift corrections四色荧光分析检测Detection LimitsDetection Limits检测效果分析比较ATCG800 nm DetectorLaser800 nm700 nm Detector700 nmLaserSignal ProcessingComputer电泳带型检测电泳带型检测700800测序
7、电泳图谱测序电泳图谱Channel700Channel800测序结果输出长片段测序策略BI-DIRECTIONAL BI-DIRECTIONAL SEQUENCINGSEQUENCING5335IRD700IRD800Two Primers/Template TTCAGAC-PRIMERPRIMER-AAGTCTG2000 basesSBS OptionsSBS Optionsn nMinimum overlapLargest single strand coverageLargest single strand coverageInserts 2 kbInserts 2 kbn nMaxim
8、um overlapConfirmed sequence in one tubeConfirmed sequence in one tubeInserts of 1200 basesInserts of 1200 bases12000 Bases11000 Bases长片段的正反向测序长片段的正反向测序Side ViewSide View测序硬件Long ReadIR DNA SequencerGene ReadIR DNA Analysis SystemBIOTECHNOLOGY DIVISIONSoftwareSoftwareMultitaskingMultitaskingBaseBase ImagIR ImagIRSoftwareSoftware 3- 3-Data=AccuracyData=AccuracyDNADNA测序的应用测序的应用n nSequencingn nMutation Screeningn nMutation Analysisn nForensic Human Identificationn nMapping Studiesn nPrimer Extensionn nFootprinting总结n n单击查看DNA测序原理过程和策略
