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1、精品文档 RNA 浓度的 OD 比值说明 OD260/OD280=1.92.0 说明 RNA 居多,纯度已经很高了。 纯 DNA:OD260/OD2801.8(1.9,表明有 RNA 污染;1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯 RNA:1.7 OD260/OD2802.0(1.7 时表明有蛋白质或酚污染;2.0 时表明可能有异硫氰酸残存 一般来说 OD260代表核酸的吸光度, OD280代表蛋白质的吸光度, OD230代表其他杂质 (多糖等)的吸光度。A 代表吸光值,而 OD 是光密度值,一个意思。 当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间,A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的
2、曲线时, 少量苯酚(30 ul/ml)残留会使 A230,A260,A280 均变大(差不多增加一倍) ,但 A260/A280 和A260/A230 均在 2 左右。 少量异硫氰酸胍(132 uM)残留使 A230 变大,但 A260,A280 几乎不变,所以 A260/A280仍在 2 左右,而 A260/A230 大大低于 2。 大量异硫氰酸胍(2.4 M)残留使 A230,A260,A280 均变大,根本就没有办法测定了。 PEG (6.25%) 残留使 A230, A260, A280 均变大, 但对 A230, A260 影响更大, 所以 A260/A280比 2 大不少,而 A2
3、60/A230 仍在 2 左右。 核酸抽提中常用的试剂,如 Phenol,GuanidineIsothiocyanate,PEG 都能使 A260 和 A280 的值变大,但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为 A260 值几乎是峰值,所以有必要在其两边各取一个:A280 和 A230。干净的核酸 A260/A230 应该在 2 左右。如果有在 230 nm 处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物 解决办法: 1. 蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得 RNA 的OD260
4、/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。 精品文档 2. 苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。 3. 多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致 OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取 RNA 时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4. 设备限制:测定 OD260及 OD280数值时,要使 OD260读数在 0.10.5 之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测 OD 值时,对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 比值低可能有蛋白污染,高了可能有 DNA 污染,建议你抽提的 RNA 分三管,两管保存,另一管用来跑胶和测定 OD,跑胶是最直观的,1%的胶就可以,抽提后马上跑,一般不会降解很多, 所以设备材料不需要去酶处理不会有影响的。 你的 OD 比值低可能是溶解时用的水的 PH 值偏酸。可以试着调到 8.0 左右再测,这样就会上来了。