《实验二植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验二植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增课件（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二 植物基因组植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增1、植物基因组植物基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化一、实验原理一、实验原理 核核酸酸包包括括DNA、RNA两两种种分分子子，在在细细胞胞中中都都是是以以与与蛋蛋白白质质结结合合的的状状态态存存在在。真真核核生物的染色体生物的染色体DNA是双链线性分子，原核生物的是双链线性分子，原核生物的“染色体染色体”、质粒及真核细胞器、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子，有些噬菌体为双链环状分子，有些噬菌体DNA有时为单链环状分子。有时为单链环状分子。95%的真核生物的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它主要存
2、在于细胞核内，其它5%为细胞器为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。，如线粒体、叶绿体等。 从细胞中分离得到的从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量，其中还含有大量RNA，即核，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于不溶于0.14mol/L 的的NaCl溶液而溶液而RNA能溶
3、能溶于于0.14mol/L 的的NaCl溶液这一性质可以将溶液这一性质可以将DNA核蛋白和核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞核蛋白从样品破碎细胞液中分开。液中分开。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有3 3种：种： 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而去变性蛋白质。用这种方
4、法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNADNA则溶于上层水相，用两倍体积则溶于上层水相，用两倍体积95%95%乙醇溶液可将乙醇溶液可将DNADNA钠盐沉淀出来。钠盐沉淀出来。 用用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可从材料中直接提取出从材料中直接提取出DNADNA。 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNADNA与蛋白质分离开来。这时与蛋白质分离开来。这时DNADNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，
5、吸出上层水相，加入两倍体积的吸出上层水相，加入两倍体积的95%95%乙醇即可得到白色纤维状乙醇即可得到白色纤维状DNADNA沉淀。反复沉淀。反复使用上述方法多次处理使用上述方法多次处理DNADNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的得到较纯的DNADNA制品。本实验采用制品。本实验采用CTABCTAB法从植物幼苗中提取基因组法从植物幼苗中提取基因组DNADNA。 为了彻底除去为了彻底除去DNADNA制品中混杂的制品中混杂的RNARNA杂质，可用杂质，可用RNARNA酶进行处理。另外，酶进行处理。另外，生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖
6、，这些物质在用盐溶液分离核蛋白生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增 核酸纯化目标：核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNARNA分子污
7、染。分子污染。 操作注意事项：操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-pH4-1010；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除类分子，去除RNARNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。的生
8、物材料和待提取的核酸分子特点而定。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增二、仪器设备二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱三、材料及试剂三、材料及试剂1. 1. 材料材料：水稻幼苗：水稻幼苗2. 2. 试剂试剂： 2CTAB2CTAB提提取取液液( (内内含含2%CTAB2%CTAB、1.4mol/L 1.4mol/L NaClNaCl、25mmol/L 25mmol/L EDTAEDTA、0.2%0.2% - -巯巯基乙醇和基乙醇和0.1mol/LTris-HCl0.1mol/LTris-HCl
9、，pH8.0)pH8.0)：取：取2g CTAB2g CTAB、8.18g NaCl8.18g NaCl、0.74g 0.74g EDTA-Na2.2H2OEDTA-Na2.2H2O，加入，加入10ml 1mol/L10ml 1mol/L的的Tris-HCl(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)和和0.2ml0.2ml - -巯基乙醇，巯基乙醇，加双蒸水加双蒸水(ddH2O)(ddH2O)定容到定容到100ml100ml； 氯仿氯仿: :异戊醇异戊醇(24:1) (24:1) 洗涤缓冲液洗涤缓冲液(70%(70%乙醇，内含乙醇，内含10mmol/L10mmol/L乙酸铵乙酸铵) )：取：
10、取70mL70mL无水乙醇和无水乙醇和0.077g0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到乙酸铵，加双蒸水定容到100ml100ml； 无水乙醇、无水乙醇、70%70%乙醇；乙醇； TE TE缓冲液：内含缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA1 mmol/L EDTA，pH8.0pH8.0实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增四、操作步骤四、操作步骤 取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分装于取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管管中，加入中，加入0.7ml
11、60水浴中预热的水浴中预热的2CTAB提取液和提取液和20 l - -巯基乙醇，轻轻转动使之混匀；巯基乙醇，轻轻转动使之混匀；样品于样品于6060温浴温浴45min45min，每，每5min5min将将Eppendorf管上下颠倒管上下颠倒混匀；混匀；加入等体积氯仿加入等体积氯仿: :异戊醇异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，室温下轻轻颠倒混匀，室温下放置放置5min5min，6000g6000g离心离心10min10min。 上层溶液转入另一个干净上层溶液转入另一个干净Eppendorf 管中，加入等体积管中，加入等体积的氯仿的氯仿: :异戊醇异戊醇(24:1)，混匀，混匀，000g转离心转离
12、心5min；重复步骤重复步骤 2-3 2-3次，次，直至无白色界面物质直至无白色界面物质 ；实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/32/3体积的预体积的预冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20-20下放置下放置30min30min，44、10000g10000g转离心转离心10min10min，弃上清液；，弃上清液；沉淀用加入沉淀用加入1ml1ml洗涤缓冲液，洗涤缓冲液，10000g10000g离心离心1-2min1-2m
13、in； 沉淀用无水乙醇洗沉淀用无水乙醇洗1 1次，次， 10000g 10000g离心离心1-2min1-2min；沉淀置于空气中沉淀置于空气中3-5min3-5min，晾干后加入，晾干后加入15-20 15-20 l l无菌水溶无菌水溶解；解；DNADNA含量测定及电泳检测，琼脂糖浓度为含量测定及电泳检测，琼脂糖浓度为0.8%0.8%。 取取2-52-5 lDNAlDNA溶液稀释至溶液稀释至100100 l l，于紫外核酸蛋白检测仪上，于紫外核酸蛋白检测仪上测定测定A260A260、A280A280和和A320A320的的ODOD值，并计算值，并计算DNADNA浓度和得率。浓度和得率。 注：
14、核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm260nm，在波长，在波长260nm260nm紫外线下，紫外线下，1 1 g/mLg/mL的的DNADNA溶液溶液A260=0.020A260=0.020，1 1个个ODOD值的光值的光密度相当于双链密度相当于双链DNADNA浓度为浓度为5050 g/mlg/ml，单链，单链DNADNA或或RNARNA为为4040 g g /ml/ml，单链寡核苷酸为，单链寡核苷酸为2020 g/mlg/ml。纯的。纯的DNADNA的的A260/A280A260/A280在在1.81.8左左右。右。实验二植物基因组实验二植物基因组DNA
15、DNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增2、 RAPD技术在生产上的应用-杂交水稻种子纯度的鉴定(RAPD 扩增)一、实验原理一、实验原理 传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。传统的种子纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子
16、生物学技术被鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如蛋白质电泳和分子标记成功地引入到种子纯度的鉴定中，如蛋白质电泳和分子标记等。等。 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。广义的分子标记包括同工酶标记和义的分子标记包括同工酶标记和DNADNA标记，狭义的分子标记仅指标记，狭义的分子标记仅指DNADNA标记。标记。DNADNA标记主要有：标记主要有：1. RFLP (Restriction Fragment 1. RFLP (Restriction Fragment Length Pol
17、ymorphism Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性即限制性片断长度多态性) )。它是由于核。它是由于核酸序列不同而造成的酸序列不同而造成的DNADNA限制性片断之间产生等位基因差异的结限制性片断之间产生等位基因差异的结果。果。 实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性，随机扩增多态性DNA)DNA)。3. 3. AFLP (Ampli
18、fied Fragment Length PolymorphismAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态，扩增片段的长度多态性性) )。4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态特异性扩增长度多态性性) )。5. 5. 微卫星微卫星DNA (Microsatellite Repeats) DNA (Microsatellite Repeats) 也称为简单串联重复序列也称为简单串联重复序列 (S
19、imple Sequence Repeat(Simple Sequence Repeat简称简称SSR)SSR)。6.6.小卫星小卫星DNA(MinisaTel-lte DNA)DNA(MinisaTel-lte DNA)也也称为数目可变串联重复序列称为数目可变串联重复序列(Variable Numbe of Tandem Repeat(Variable Numbe of Tandem Repeat简称简称VNYR)VNYR)。 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多
20、态性，随机扩增多态性DNA)DNA)是是19901990年由美国科学家年由美国科学家J.G.K.WilliamsJ.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所和加利福尼亚生物研究所J.WelshJ.Welsh领导领导的两个小组几乎同时发展起来的一种的两个小组几乎同时发展起来的一种DNADNA指纹技术，它是以指纹技术，它是以DNADNA为模板，以一为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列个随机的寡聚核苷酸序列(10(10个碱基个碱基) )为引物，通过为引物，通过PCRPCR扩增，产生分子量大扩增，产生分子量大小不连续的小不连续的DNADNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检
21、测DNADNA多态性。多态性。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增 DNADNA多态性是指多态性是指DNADNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之间，它们的基因组间，它们的基因组DNADNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，用限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自各自DNADNA为模板，以一个随
22、机的寡聚核苷酸序列为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10(10个碱基个碱基) )为引为引物，通过物，通过PCRPCR扩增，产生分子量大小不连续的扩增，产生分子量大小不连续的DNADNA片段，通过琼片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异，这就是可直接看到这种差异，这就是RAPDRAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理。定的工作原理。 PCR( PCR(聚合酶链式反应聚合酶链式反应) )，即通过引物延伸核酸的某个区域而，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向进行的
23、重复双向DNADNA合成。合成。PCRPCR循环过程有三种不同的事件发循环过程有三种不同的事件发生：生：1. 1. 模板变性（模板变性（92-9692-96）；）；2. 2. 引物退火（引物退火（37-6537-65）；）；3. 3. 热稳定热稳定DNADNA聚合酶进行聚合酶进行DNADNA合成合成-延伸（延伸（7272）。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增94，模板模板变性变性基因组基因组DNADNA单链单链DNADNA引物退火引物退火引物与模板靶序列互补杂交引物与模板靶序列互补杂交一一段段与与模模板板DNADNA互互补补的新链的新链
24、第二个循环结果第二个循环结果实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增 变性、退火、延伸的循环过程变性、退火、延伸的循环过程-PCR-PCR扩增。在第二个循环扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNADNA扩增扩增一倍，一倍，25-3525-35个循环后，目的个循环后，目的DNADNA将达到将达到10106 6倍。琼脂糖电泳、倍。琼脂糖电泳、EBEB染色即可得到染色即可得到DNADNA指纹图谱。指纹图谱。PCRPCR反应体系反应体系(25(25 l)l)：1010 P
25、CR buffer 2.5PCR buffer 2.5 l ldNTP (10mmol/L) 0.5dNTP (10mmol/L) 0.5 l l引物引物(15ng) 1.0(15ng) 1.0 l lTaq Taq 酶酶 0.5 0.5 l l模板模板DNA(DNA(纯纯DNA15ngDNA15ng，提取，提取DNA100ng) 100ngDNA100ng) 100ngddHddH2 2O XO X l l 实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增反应程序：反应程序： 945min (9430s 361min 721min) 945min
26、(9430s 361min 721min) 725min 4 725min 4保存保存35cycles35cycles实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增相关知识一、核酸定量一、核酸定量 在波长在波长260nm260nm紫外线下，紫外线下，1OD1OD值的光密度相当于双链值的光密度相当于双链DNADNA浓度为浓度为5050 g g /ml/ml；单链；单链DNADNA或或RNARNA为为4040 g/mlg/ml；单链寡核苷酸为；单链寡核苷酸为2020 g/mlg/ml。二、分子标记种类二、分子标记种类1.1.RFLP (Restrict
27、ion Fragment Length Polymorphism RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断即限制性片断长度多态性长度多态性) )。它是由于核酸序列不同而造成的。它是由于核酸序列不同而造成的DNADNA限制性片断之间产生等限制性片断之间产生等位基因差异的结果。要检测到位基因差异的结果。要检测到RFLPRFLP，在提取核在提取核DNADNA后用限制性内切酶酶后用限制性内切酶酶解，酶解后的片断通过电泳依大小而分开，将这些片断在变性后转移到固解，酶解后的片断通过电泳依大小而分开，将这些片断在变性后转移到固体支持物如尼龙膜
28、上，然后再用具有放射性标记的体支持物如尼龙膜上，然后再用具有放射性标记的DNADNA探针进行杂交，放探针进行杂交，放射性自显影后得到射性自显影后得到RFLPRFLP条带。在观察到一个条带。在观察到一个RFLPRFLP时，可用检测出该时，可用检测出该RFLPRFLP的的探针探针酶的组合追踪该酶的组合追踪该RFLPRFLP位点在作图群体中的遗传情况。位点在作图群体中的遗传情况。RFLPRFLP标记的优标记的优点在于它的标记数量较大点在于它的标记数量较大, ,理论上可以布满整个基因组；理论上可以布满整个基因组；实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩
29、增其次，它的其次，它的标记标记呈共呈共显显性，性，可以区别纯合基因型和杂合基因型，并且标记可以区别纯合基因型和杂合基因型，并且标记遵循孟德尔遗传规律；另外，遵循孟德尔遗传规律；另外，RFLPRFLP标记可靠性强，不受显隐性关系、基因标记可靠性强，不受显隐性关系、基因互作、下位效应、发育阶段、环境条件以及基因是否表达的影响。但由于互作、下位效应、发育阶段、环境条件以及基因是否表达的影响。但由于标记技术复杂、操作繁琐、工作量大、具有放射性的危害，标记技术复杂、操作繁琐、工作量大、具有放射性的危害，DNADNA用用量较大量较大(5(51010) )、纯度要求较高、纯度要求较高, ,因此限制了它在实际
30、中的广泛使用。因此限制了它在实际中的广泛使用。利用标记利用标记, ,可以构建连锁图谱可以构建连锁图谱, ,从而可以进行区间定位从而可以进行区间定位, ,可以可以进行标记辅助筛选，可以对主效基因进行定位和克隆。进行标记辅助筛选，可以对主效基因进行定位和克隆。2. RAPD (Random 2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Amplified Polymorphic DNA, 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA)DNA)。它是。它是19901990年由美国科年由美国科学家学家J.G.K.WilliamsJ.G.K.Williams和加利福尼亚生物
31、研究所和加利福尼亚生物研究所J.WelshJ.Welsh领导的两个小组几乎领导的两个小组几乎同时发展起来的一种同时发展起来的一种DNADNA指纹技术，它是以指纹技术，它是以DNADNA为模板，以一个随机的寡聚为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列核苷酸序列(10(10个碱基个碱基) )为引物，通过为引物，通过PCRPCR扩增，产生分子量大小不连续的扩增，产生分子量大小不连续的DNADNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNADNA多态性。一般讲多态性。一般讲, ,通过通过PCRPCR扩增产扩增产生的不连续的几个生的不连续的几个DNADNA产物产物, ,往往是由于不同的遗
32、传位点而产生往往是由于不同的遗传位点而产生, ,多态性的产多态性的产生是由于突变或重排而造成的生是由于突变或重排而造成的, ,这些变化可以发生在引物结合位点上这些变化可以发生在引物结合位点上, ,也可也可实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增以位于引物结合序列之间。以位于引物结合序列之间。RAPDRAPD是一种显性的遗传标记，与是一种显性的遗传标记，与RFLPRFLP标记相比，标记相比，其标记数量多其标记数量多, ,标记的分辨率高，特异性强，标记的分辨率高，特异性强，DNADNA用量较少用量较少(50(50),),对对DNADNA的质量要求
33、也不及的质量要求也不及RFLPRFLP标记技术，同时标记技术，同时,RFLP,RFLP技术依赖于技术依赖于PCRPCR技术技术, ,因而它具因而它具有快速、方便、高效的特点有快速、方便、高效的特点, ,因此常常被广泛用于基因的快速定位和遗传作因此常常被广泛用于基因的快速定位和遗传作图。但由于图。但由于RAPDRAPD受反应条件影响大受反应条件影响大, ,因而检测的重复性较差，会产生一些假因而检测的重复性较差，会产生一些假象的多态性。其次，象的多态性。其次，RAPDRAPD标记为显性标记，不能用来区别杂合和纯合基因标记为显性标记，不能用来区别杂合和纯合基因型。型。3. AFLP (Amplifi
34、ed Fragment Length Polymorphism3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长，扩增片段的长度多态性度多态性) )。广义的。广义的AFLPAFLP是指所有的经是指所有的经PCRPCR反应产生的片段长度的多态性的总反应产生的片段长度的多态性的总称，而狭义的称，而狭义的AFLPAFLP专指一种基于专指一种基于PCRPCR反应的反应的AFLPAFLP，这是一种选择性地扩增限，这是一种选择性地扩增限制性片段的方法。在操作过程中，往往先提取核制性片段的方法。在操作过程中，往往先提取核DNADNA，并用内切酶降解，
35、之，并用内切酶降解，之后再连接一个接头后再连接一个接头, ,依据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物依据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物, ,即引物即引物= =接接头头+ +酶切位点酶切位点+2+23 3个随机的核苷酸，之后再进行特异性个随机的核苷酸，之后再进行特异性PCRPCR扩增，这种扩增，这种技术技术实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增将将RFLP的随机性与专一性扩增进行巧妙地结合，又通过不同的内切酶以达的随机性与专一性扩增进行巧妙地结合，又通过不同的内切酶以达到选择的目的，故又称为选择性限制片段扩增标记到选择的目的，故又称为选择性
36、限制片段扩增标记(Selectine Restriction Fragment Amplification 简称简称SRFA)。AFLP标记所检测的多态性是酶切位标记所检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间点的变化或酶切片段间DNA序列的插入与缺失，本质上与序列的插入与缺失，本质上与RFLP一致。与上一致。与上面两种标记技术相比，由于它结合面两种标记技术相比，由于它结合RAPD与与RFLP的特长的特长,因而它所提供的因而它所提供的基基因组多态性信息比因组多态性信息比RFLP、RAPD多。此外，多。此外，AFLP标记稳定性强，重复性标记稳定性强，重复性好，自动化程度高，标记呈显性或共显性，对好
37、，自动化程度高，标记呈显性或共显性，对DNA的数量及质量要求低，的数量及质量要求低，并且可以通过控制引物的数目和种类来选择不同的并且可以通过控制引物的数目和种类来选择不同的DNA片段以及扩增的片段以及扩增的DNA片段的数目片段的数目,因而在实际应用中有着非常好的前景。因而在实际应用中有着非常好的前景。4SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态性特异性扩增长度多态性)。扩增长度多态性。扩增长度多态性)。它。它是在是在RAPD和和RFLP分析中找到多态性分析中找到多态性DNA片段后，将该片段两端测序片段后，将该片段两端测序,依依据所测据所测DNA
38、序列序列,重新设计双引物进行特异性扩增重新设计双引物进行特异性扩增,这种标记方法又这种标记方法又称为序列特异性扩增区称为序列特异性扩增区(Sequence Characterizal Amplified Region 简称简称SCAR)。SCAR在不同个体间可能表现为存在在不同个体间可能表现为存在/缺失缺失,为显性标记为显性标记,也可能表也可能表现现实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增为扩增片段长度的差异为扩增片段长度的差异,为共显性标记。利用为共显性标记。利用SAP标记可以解决标记可以解决RFLP标记中标记中PCR扩增片段多扩增片段多,
39、不易分析结果及重复的缺点。不易分析结果及重复的缺点。5. 微卫星微卫星DNA (Microsatellite Repeats)也称为简单串联重复序列也称为简单串联重复序列(Simple Sequence Repeat简称简称SSR)。它是。它是基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复,由于等位基因间由于等位基因间重重复次数不同而产生多态性复次数不同而产生多态性,其检测也采用其检测也采用PCR扩增。与扩增。与RFLP标记相比标记相比,微卫微卫星星DNA多态性较高，但构建一张完整的微卫星图谱多态性较高，但构建一张完整的微卫星图谱,工作量大
40、，费用也高，因工作量大，费用也高，因而在实际中用的较少。而在实际中用的较少。6. 小卫星小卫星DNA (Minisatellte DNA)也称为数目可变串也称为数目可变串联重复序列联重复序列(Variable Numbe of Tandem Repeat简称简称VNYR)。小卫星。小卫星DNA是是一种重复的一种重复的DNA小序列小序列,为十到几百个核苷酸为十到几百个核苷酸,在基因组中拷贝数从在基因组中拷贝数从1010000不等不等,分散或成簇分布分散或成簇分布,多态性的产生是由于重复单位间的不平衡交换多态性的产生是由于重复单位间的不平衡交换,从而从而产产生不同的等位基因的结果。小卫星生不同的等位基因的结果。小卫星DNA多态性很高多态性很高,但是由于缺乏探针因而但是由于缺乏探针因而操作起来比较繁琐操作起来比较繁琐,同时小卫星同时小卫星DNA分布较集中分布较集中,因此使它们的应用受到了限因此使它们的应用受到了限制。制。实验二植物基因组实验二植物基因组DNADNA的分离纯化及的分离纯化及RAPDRAPD扩增扩增
