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1、第九章第九章 外源基因的表达外源基因的表达基因表达是分子克隆的主要任务之一。表达包括转录、翻译与转录、翻译与翻译后加工、分离纯化翻译后加工、分离纯化等过程。根据被表达的基因和表达基因所用的系统。可将表达分为四种：l原核基因在原核细胞中表达。l真核基因在原核细胞中表达。l原核基因在真核细胞中表达。l真核基因在真核细胞中表达。表达系统主要为原核和真核系统。n 原核表达系统主要有：大肠杆菌系统 枯草杆菌系统等。n 真核表达系统主要有：酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统、昆虫细胞(杆状病毒系统)和高等植物系统等。目的基因表达载体表达载体宿主细胞表达体系融合蛋白非融合蛋白第一节第一节 外源基因在大肠杆菌中表
2、达外源基因在大肠杆菌中表达 二、常用的大肠杆菌的表达载体二、常用的大肠杆菌的表达载体(一) 表达载体的条件 在原核克隆载体中通常都带一个在原核克隆载体中通常都带一个松弛型复制子松弛型复制子、一个、一个多克隆位点多克隆位点和一个筛选标记和一个筛选标记，以便被，以便被克隆和筛选克隆和筛选的的DNADNA序列能够大量增殖。序列能够大量增殖。 有强启动子有强启动子、核糖体结合位点核糖体结合位点、转录起始信号转录起始信号、转录终止信号转录终止信号、翻译起始密码子和终止密码子翻译起始密码子和终止密码子等一系列等一系列调控序列调控序列。 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然蛋白，所表达的蛋白质是
3、融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然蛋白，必须考虑如何将目的必须考虑如何将目的基因准确地与载体衔接基因准确地与载体衔接。如果是融合蛋白，。如果是融合蛋白，则可以用三种不同阅读框架的载体使则可以用三种不同阅读框架的载体使目的基因与载体序列吻合目的基因与载体序列吻合。 Problems with reading frames in fusion proteins Ensuring correct insertion of a gene 被表达的基因是原核基因还是真核基因。被表达的基因是原核基因还是真核基因。原原核基因一般都带有核糖体结合位点，只需考核基因一般都带有核糖体结合位点，只需考虑它是否带有强启
4、动子虑它是否带有强启动子。对真核基因除考虑对真核基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，还须还须 考虑该基因是否会产生翻译后加工，以考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真核表达系统中表达等后是否需要转到真核表达系统中表达等。核糖体结合位点核糖体结合位点(ribosome-binding site)又称又称SD序列序列(Shine-Dalgaro senquence)，它是指，它是指mRNA分子中能与核分子中能与核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面312个碱基，个碱基，该序列与该序列与
5、16s rRNA的的3端互补。端互补。16S rRNA 3 HOAUUCCUCCAUAG.5噬菌体噬菌体MS2外壳蛋白外壳蛋白 5.UCAACCGGAGUUUGAAGCAUG.3复制酶复制酶 5.CAAACAUGAGGAUUACCCAUG.3噬菌体噬菌体Cro 5.AUGUACUAAGGAGGUUGUAUG.3galE 5.AGCCUAAUGGAGCGAAUUAUG.3-内内酰胺胺酶酶 5UAUUGAAAAAGGAAGAGUAUG.3脂蛋白脂蛋白 5.AUCUAGAGGGUAUUAAUAAUG.3核糖体蛋白质核糖体蛋白质S12 5.AAAACCAGGAGCUAUUUAAUG.3RNA聚合酶聚合
6、酶5.AGCGAGCUGAGGAACCCUAUG.3trpE 5.CAAAAUUAGAGAAUAACAAUG.3核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响SDSDSDSD序列的影响：序列的影响：序列的影响：序列的影响：一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响：序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游的碱基若为AAAA或UUU
7、U，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始tRNA分子
8、可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： l 生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链
9、DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高； 而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势l 密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；l 细胞内细胞内tRNA的含量的含量密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性。因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高大的差异性，因此外源基因尤其是高
10、等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：l 外源基因全合成外源基因全合成l 同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因n 外源基因全合成法外源基因全合成法按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。n 同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如
11、，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有有信号肽序列信号肽序列，故应选择带适当信号肽序列的载体。，故应选择带适当信号肽序列的载体。信号肽信号肽(Signal Peptide)又称前导肽又称前导肽(Lea
12、der Peptide)，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约端上长约1530个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。来。 所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载割加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体序列间应有适当的体序列间应有适当的切割识别序列切割识别序列。 Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切
13、割方便： pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体是否需要用是否需要用强启动强启动于提高表达水平。当需要提高表于提高表达水平。当需要提高表达水平时，可选用强启动子。但是在某些情况下，达水平时，可选用强启动子。但是在某些情况下，由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质不利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才能被表达。才能被表达。质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响，目前实验室里广泛使用的表达型质
14、粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入重组质粒的扩增纳入重组质粒的扩增纳入重组质粒的扩增纳入可控制的轨道可控制的轨道可控制的轨道可控制的轨道。将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的
15、蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白(二) 常用的表达载体1.融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体以大肠杆菌基因与外源目的蛋白基因组成融合基因产生的融合蛋白，可用作抗原产生抗体，然后用这种抗体测定或分离天然的目的蛋白。产生融合蛋白有下列优点： 转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故通常可以产生高水平的融台蛋白 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。
16、 有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。 l 受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化层析进行特异性简单纯化亲和层析进行特异性简单纯化层析进行特异性简单纯化l 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着为目的蛋白分离回收创造条件为目的蛋白分离回收创造定着为目的蛋白分离回收创造条件为目的蛋白分离回收创造条件条件l 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止
17、密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件于接近，为目的蛋白分离回收创造条件l 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架融合型表达融合谷胱肽巯基转移酶Tac启动子Lac操纵基因SD序列LacI阻遏蛋白基因亲和层析纯化融合蛋白凝血酶或Xa因子切割融合蛋白成完全天然蛋白代表载体pGEX 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被
18、膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2. 包涵体蛋白表达载体包涵体蛋白表达载体Trp的-35区+LacUV5的-10区和操作子和S-D序列终止子在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可
19、分为在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。是蛋白质分泌的前提条件。3. 分泌型蛋白表达载体分泌型蛋白表达载体包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋
20、白，它激活定位于内内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。脂蛋白基因启动子+Lac UV5启动子外膜蛋白基因4. 寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组
21、质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略第二节第二节 提高外源基因在大肠杆菌中提高外源基因在大肠杆菌中表达效率表达效率(1) 以融合蛋白融合蛋白表达目的蛋白提高融合蛋白的稳定性相产量。 (2)使用强启动子强启动子提高mRNA产量，并在基因下
22、游加入稳定mRNA的强转录终止子强转录终止子，防止转录过度。 (3) 调整调整SD序列与序列与ATG间的距离。间的距离。SD序列与ATG的距离过长或过短都会影响目的基因 的表达，有时由于这种距离的影响蛋白质合成会相差2000倍以上。应该在目的基因ATG下游 100bp左右开始，用酶切形成不同长度的片段，与带启动子和SD序列的载体连接后，产生一系 列重组DNA。从中选择产生高水平天然目的蛋白的重组体。 (4) 利用蛋白酶缺陷型的宿主蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon营养缺陷型减少外源蛋白的降解。(5) 在宿主内表达蛋白酶抑制产物表达蛋白酶抑制产物，从而抑制蛋白酶的活性。例如将T4噬茵体的pin基因
23、克隆和转化到E. coli中，抑制蛋白酶活性。 (6) 使蛋白质分泌分泌到体外，减少反馈抑制或蛋白酶降解。 (7) 调整带目的基因的表达质粒的拷贝数拷贝数，增加模板数。例如使用pKN402载体 拷贝数与温度有关，故改变温度可增加目的基因的拷贝数。 (8) 利用诱导物诱导物进行表达表达。过早地大量表达外源基因往往影响宿主细胞的繁殖，因此当不 表达时，可使宿主细胞迅速繁殖生长得到较大的生物量，然后利用诱导物诱导目的基因表达。 (9)人工合成目的基因，在不改变蛋白质氨基酸的前提下，根据简并性，利用宿主偏爱的密码子利用宿主偏爱的密码子改变部分碱基序列， (10) 定点诱变，消除消除核糖体结合位点附近可
24、能的二级结构可能的二级结构，这种二级结构会影响翻译起始 效率。 (1) Northern杂交杂交。检查细胞中是否含有恃定的mRNA，测定特定mRNA在总RNA中的 比例，由此获得日的mRNA的转录情况。 (2) 斑点杂交斑点杂交。用特异性探针检查mRNA，并估计表达过程中mRNA的转录强度。(3) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平。如表达水平 很低，也可用同位素，如35S甲硫氨酸或35S半肮氨酸进行代谢标记，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，或在Western杂交中用待异性抗体分析目的蛋白质的存在及其含量。 第三节第三节 表达产物的
25、检测表达产物的检测(4) 免疫学方法。免疫学方法。利用特异性抗体与目的蛋白进行反应，经免疫沉淀、ELISA等免疫学方法，检测基因表达的强度。 (5) 直接测定目的蛋白的生物活性直接测定目的蛋白的生物活性，根据生物活性的大小估计蛋白质的表达量。但这种方法往往由于所表达蛋白质无活性而不能准确测定目的蛋白的表达量。 (6) 将报告基因报告基因(例如lac)克隆在目的基因下游在目的基因下游，根据报告基因转录或翻译的情况，估计目的蛋白的表达量。Example 1 草鱼蛋白基因的克隆与原核表达包涵体Example 2 邻苯二酚2,3 双加氧酶基因克隆、定位和高效表达 张杰刘永生冯家勋柏学亮张忠泽Protr
26、opin (Genentech) and Humatrope (Eli Lilly) Native human GH contains signal peptide needed to direct nascent polypeptide to RER in eukaryotesSignal peptide is bad for E.coli (it can not synthetize this protein)Signal sequence removed be EcoRI cleavageCoding sequence for first 24 aa also lost in the process of removal24 amino acids added back by synthetic DNA linkerExpressed in E. coli successfullyhGH therapy is very expensive, costing anywhere from $800 to $2,500 a month
