体内药物分析生物样品与样品制备课件

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1、第三章生物样品与样品制备药物分析教研室药物分析教研室8/19/20241体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备生物样本生物样本体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备学习要求学习要求o掌握掌握 常用生物常用生物 样本（样本（血液、尿液及组织血液、尿液及组织）的采集、制备、贮存及预处理方法。的采集、制备、贮存及预处理方法。o熟悉常用样品的预处理技术。熟悉常用样品的预处理技术。o了解非常用样本的制备与处理方法。了解非常用样本的制备与处理方法。体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备选择生物样本的实验原则选择生物样本的实验原则 反映浓度与

2、药效之间的关系 1 易于获得，方便研究 2 便于处理，适合分析 3 根据不同目的与要求选取 4如：如：TDMTDM、药动学研究选血液、唾液等；药物代谢、药动学研究选血液、唾液等；药物代谢物研究选血液、尿液；物研究选血液、尿液；ADMETADMET研究选取研究选取？体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备第一节第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存生物样品的种类、采集、制备与贮存生物样品的种类、采集、制备生物样品的种类、采集、制备1生物样品的贮存与处理生物样品的贮存与处理28/19/20245体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备一、生物样品的种类、采集

3、和制备一、生物样品的种类、采集和制备体内药物分析常用的分析品种有体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、血液、尿液、脏器组织、脏器组织、唾液、头发，也可用乳汁、泪液、唾液、头发，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便脑脊液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等。等。其中最常用的是其中最常用的是血浆或血清血浆或血清，因为它们可以，因为它们可以较好地体现药物浓度和治疗之间的关系。较好地体现药物浓度和治疗之间的关系。8/19/20246体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（一）血液（一）血液 血样的制备，血样的制备，如果你取血样会选择血浆、血清如果你取血样会选择

4、血浆、血清还是全血？还是全血？8/19/20247体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备血液的组成血液的组成8/19/20248体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备1.血血样的采集的采集供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药待药物在血液中分布均匀后取样物在血液中分布均匀后取样。n动物实验：动物实验：可直接从动脉、静脉或心脏取血。可直接从动脉、静脉或心脏取血。n病人：病人：通常采取静脉血。通常采取静脉血。n末梢血：末梢血：当血药浓度高和分析方法灵敏时，当血药浓度高和分析方法灵敏时，也可从毛细管（手指、耳垂

5、、脚趾）采少量也可从毛细管（手指、耳垂、脚趾）采少量血。血。8/19/20249体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备采集注意事项采集注意事项 1:1-5ml1:1-5ml，动物，动物 总血量总血量1/101/10 2: 2:避免溶血避免溶血 3:3:血样是创伤性获得，尤其是多次采样血样是创伤性获得，尤其是多次采样4:4:用于药代动力学、血药浓度监测用于药代动力学、血药浓度监测根据不同的分析目的和要求进行选取根据不同的分析目的和要求进行选取体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备2.血样的制备血样的制备o测定血中药物浓度，通常是指测定测定血中药物浓度，

6、通常是指测定血浆血浆或或血血清清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。血中的药物浓度。8/19/202411体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备血样血样o全血全血(whole blood)n全血含有血球，药物在血球内与血浆中的浓度比全血含有血球，药物在血球内与血浆中的浓度比由于受各种因素的影响而变化由于受各种因素的影响而变化n血球膜及血红蛋白会妨碍药物浓度的测定血球膜及血红蛋白会妨碍药物浓度的测定o血浆血浆(plasma)o血清血清(serum)8/19/202412体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样

7、品制备（1）血浆的制备）血浆的制备o血液置于含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）血液置于含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡黄色上清液即为血浆。黄色上清液即为血浆。8/19/202413体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备制备条件制备条件o抗凝抗凝剂：肝素肝素(heparin)15IU抗凝抗凝1ml血血浆o离心：离心：25003000r min-1低速离心低速离心510 mino取上清液（淡黄色）取上清液（淡黄色）8/19/202414体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（2）血

8、清的制备）血清的制备o采集的静脉血液置采集的静脉血液置试管中，放置管中，放置0.5 1 h，由，由于激活了一系列凝血因子，血中的于激活了一系列凝血因子，血中的纤维蛋白蛋白原原形成形成纤维蛋白，血液逐蛋白，血液逐渐凝固，离心后上凝固，离心后上层澄清的淡黄色液体即澄清的淡黄色液体即为血清。血清。8/19/202415体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备血浆与血清的相同之处血浆与血清的相同之处o药物浓度相同药物浓度相同Cplasmaplasma=C=Cserumserumo因此：因此：n血清和血浆可任意选用血清和血浆可任意选用n分析方法相互通用分析方法相互通用n血药浓度，均指

9、药物的总浓度（游离型血药浓度，均指药物的总浓度（游离型+结合型）结合型）8/19/202416体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（3）全血的制备）全血的制备o采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细胞混合在一起。胞混合在一起。8/19/202417体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备使用全血的原因使用全血的原因1.1.需要测全血中血药浓度的情况需要测全血中血药浓度的情况2.2.测定平均分布于血细胞内、外的血药浓度测定平均分布于血细胞内

10、、外的血药浓度3.3.血浆药物浓度波动大，且难以控制血浆药物浓度波动大，且难以控制4.4.血浆药物浓度太低血浆药物浓度太低2024/8/1918体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备示例：示例：o环孢素环孢素A A的全血浓度的测定的全血浓度的测定体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备血样主要应用于：血样主要应用于：u 药物动力学药物动力学u 生物利用度生物利用度u 临床治疗药物浓度监测临床治疗药物浓度监测血样的应用血样的应用8/19/202420体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o血样的缺点血样的缺点n损伤性采样，取样量受到

11、限制（损伤性采样，取样量受到限制（15ml）n繁琐，多次采血繁琐，多次采血n病人病人/受试者不愿配合受试者不愿配合n由专人进行由专人进行21体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（二）尿液（二）尿液o尿药测定的目的与血液、唾液样品不同，主尿药测定的目的与血液、唾液样品不同，主要用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、要用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度的研究生物利用度的研究o可推断患者是否违反医嘱用药可推断患者是否违反医嘱用药o预测药物的代谢过程及测定代谢类型预测药物的代谢过程及测定代谢类型22体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备尿液尿液1

12、:1:尿液特点尿液特点 量大；非创伤性；尿液中药浓度较高。量大；非创伤性；尿液中药浓度较高。 2:2:尿液缺点尿液缺点 食物饮；水影响；排汗。食物饮；水影响；排汗。3:3:尿尿液液性性质质 淡淡黄黄色色；成成人人日日量量1-5L1-5L；pH4.8-8.0pH4.8-8.0；加加防防腐腐剂剂贮存。贮存。4:4:采采集集方方法法 采采集集24h24h尿尿液液：8 8时时排排尿尿弃弃去去，立立即即服服药药，尿尿液液收收集容器中，次日集容器中，次日8 8时最后一次收集；分段收集时最后一次收集；分段收集5:5:肾功影响药物的排泄肾功影响药物的排泄 尿药浓度与血药浓度相关性差；有尿药浓度与血药浓度相关性

13、差；有些难收集（如小孩）。些难收集（如小孩）。8/19/202423体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o动物试验中用动物试验中用代谢笼代谢笼收收集尿、粪，只能以时间集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集段采集，有时会有收集不到的情况。不到的情况。o尿药浓度变化大，应测尿药浓度变化大，应测定一定时间内排入尿中定一定时间内排入尿中药物的总量。药物的总量。o尿样测定多用于药物排尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。泄、生物转化研究。8/19/202424体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备优优 点点1.容容易易获获得得，属属非非损损伤伤性取样，且样

14、品量大；性取样，且样品量大；2.尿尿中中药药物物浓浓度度高高，含含有有缀缀合合物物或或代代谢谢物物，是是研研究究代代谢谢物物结结构构的的首选样品；首选样品；3.蛋蛋白白含含量量极极低低，不不需需去蛋白处理。去蛋白处理。 缺缺 点点1.与与血血药药浓浓度度不不相相关关，难难以以反反映映药药物物作作用用过过程；程；2.受肾功能、受肾功能、pH影响；影响；3.难难以以定定时时定定量量取取样样，易污染；易污染；4.所所含含成成分分复复杂杂，已已知知其其中中有有紫紫外外吸吸收收的的化化合物就达数十种。合物就达数十种。8/19/202425体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（三）

15、组织（三）组织o在药物动物试验及临床上由于过量服用药物在药物动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，而引起的中毒死亡时，药物在脏器中的分布药物在脏器中的分布情况情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。首先，将检材均匀体内过程提供重要信息。首先，将检材均匀化，制成水基质溶液，再用适当方法提取。化，制成水基质溶液，再用适当方法提取。8/19/202426体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备组织常用提取方法：组织常用提取方法：（1 1）匀浆化法）匀浆化法（简单，回收率低简单，回收率低）（2 2）沉淀蛋白法）沉淀

16、蛋白法（简单，回收率低简单，回收率低）（3 3）酸酸水水解解或或碱碱水水解解（适适合合于于酸酸碱碱条条件件下下稳稳定定的药物或毒物的药物或毒物）（4 4）酶酶水水解解法法（避避免免高高温温降降解解，不不适适合合碱碱性性条条件下水解的药物或毒物件下水解的药物或毒物）8/19/202427体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备实例：实例：o以下可采取哪种样品提取方法：以下可采取哪种样品提取方法： 1）利多卡因在肝脏中的组织分布？）利多卡因在肝脏中的组织分布？ 2）阿司匹林在心脏中的组织分布）阿司匹林在心脏中的组织分布体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备

17、（四）其他生物样品（自学）（四）其他生物样品（自学）1.1.1.1.乳汁（乳汁（乳汁和新生儿乳汁和新生儿）2.2.2.2.精液精液3.3.3.3.泪液泪液4.4.4.4.头发头发5.5.5.5.唾液唾液6.6.6.6.8/19/202429体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备二、生物样品的贮存与处理二、生物样品的贮存与处理（一）（一） 冷藏或冷冷藏或冷冻 o采采样后除立即分析外，后除立即分析外，为防止防止药物物发生生变化，化，应： n短期保存，可短期保存，可 4 冷藏冷藏n长期保存，可期保存，可-20 冷冷冻或低温冷柜或低温冷柜(-80)冷冷冻 ，避免反复，避免反复冻融

18、。融。冷藏或冷冻冷藏或冷冻时限时限经稳定性考察后确定经稳定性考察后确定8/19/202430体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备 采采集集后后及及时时分分离离血血浆浆和和血血清清（2h2h），分分离离后后再再贮存。贮存。若若不不予予先先分分离离，血血凝凝后后冰冰冻冻保保存存，则则因因冰冰冻冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。置硬质玻璃试管或完全密塞后保存。置硬质玻璃试管或完全密塞后保存。 反复冻融一般不超过反复冻融一般不超过2 2次，可采用次，可采用分装分装的方法。的方法。 血样血样8/19/202431体内药物分析

19、生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备尿样尿样 采采集集后后应应立立即即测测定定，若若不不能能立立即即测测定定，加加入入防腐剂后保存防腐剂后保存 常常用用防防腐腐剂剂：甲甲苯苯、二二甲甲苯苯、氯氯仿仿、醋醋酸、浓盐酸酸、浓盐酸等等 甲苯在尿液表面形成薄膜甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为保存时间为24-36h(4)24-36h(4)或长期或长期(-20)(-20)8/19/202432体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（二）去酶活（二）去酶活酶抑制剂：酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、一些酯

20、类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，则应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。则应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。抗氧化剂：抗氧化剂：一些易氧化的药物，可加入一些易氧化的药物，可加入VC或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药物常规保存仅物常规保存仅4周，若加入适量周，若加入适量VC，则能保，则能保存存10周。周。8/19/202433体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o奥氮平，很容易被空气氧化，因此在样品的奥氮平，很容易被空气氧化，因此在样品的储存和提取时加入了储存和提取时加入

21、了25%的维生素的维生素C 溶液溶液10ul 作为抗氧剂作为抗氧剂8/19/202434体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备第二节第二节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接测定外，都要将样品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取采取分离、净化、浓缩、化学衍生化分离、净化、浓缩、化学衍生化等预处理等预处理技术，为测定创造良好的条件。技术，为测定创造良好的条件。35体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o样品预处理是分析中样品预处理是分

22、析中最困难、最繁复最困难、最繁复的工作。的工作。o药物进入生物体后：药物进入生物体后： 体内存在形式不同、待测药物浓度低、生物体内存在形式不同、待测药物浓度低、生物介质组份繁杂、待测药物类型众多、理化性介质组份繁杂、待测药物类型众多、理化性质各异质各异8/19/202436体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备60%以上工作和费用用在样品前处理上1）样品预处理所用时间）样品预处理所用时间远大于分析的时间远大于分析的时间 2）占分析的消耗总成本最）占分析的消耗总成本最大大3）消耗大量的溶剂及其）消耗大量的溶剂及其他化学品他化学品 4）实验的重复性及准确性）实验的重复性及准确

23、性最差的环节最差的环节 因此是影响实验结果好因此是影响实验结果好坏的最重要因素坏的最重要因素37体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备第二节第二节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备生物样品预处理的目的生物样品预处理的目的1样品制备时应考虑的问题样品制备时应考虑的问题2常用生物样品预处理技术常用生物样品预处理技术3新兴生物样品预处理技术新兴生物样品预处理技术48/19/202438体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备药物分析样本预处理的目的药物分析样本预处理的目的o适应分析方法的要求适应分析方法的要求o消除药物制剂的处方组成消除药物制剂的

24、处方组成o多数具有特征结构和取代基的原料药可不经多数具有特征结构和取代基的原料药可不经处理，直接溶剂溶解分析处理，直接溶剂溶解分析。体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备药物分析样品前处理方法药物分析样品前处理方法1 1、不经有机破坏的前处理方法、不经有机破坏的前处理方法 不对药物的有机结构进行完全破坏，简单回流将不对药物的有机结构进行完全破坏，简单回流将待测原子解离为无机离子测定。待测原子解离为无机离子测定。 方法方法 ：水解、还原法：水解、还原法如：十一烯酸锌（酸水解）、三氯叔丁醇（碱水解、如：十一烯酸锌（酸水解）、三氯叔丁醇（碱水解、碘他拉酸（还原法）碘他拉酸（还原

25、法）2 2、经有机破坏的前处理方法、经有机破坏的前处理方法 1 1中方法难以实现，有机方法。中方法难以实现，有机方法。 方法：湿法、干法方法：湿法、干法 体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备一、生物样品预处理的目的一、生物样品预处理的目的1.1.使药物从缀合物及结合物中释放使药物从缀合物及结合物中释放 - -测定药物总浓度测定药物总浓度2.2.纯化、富集样品纯化、富集样品 - -消除基质的干扰消除基质的干扰3.3.满足测定方法对分析样品的要求满足测定方法对分析样品的要求 - -提高检测灵敏度提高检测灵敏度4.4.保护仪器性能，改善分析条件保护仪器性能，改善分析条件- -

26、改善耐受改善耐受8/19/202441体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备二、样品制备时应考虑的问题二、样品制备时应考虑的问题1.1.待测组分的理化性质、体内存在形式、浓度范围待测组分的理化性质、体内存在形式、浓度范围；2.2.测定目的；测定目的；3.3.生物样品种类和介质干扰类型生物样品种类和介质干扰类型；4.4.样品的化学组成；样品的化学组成；5.5.药物的蛋白结合率药物的蛋白结合率；6.6.待测组分在预处理中的稳定性；待测组分在预处理中的稳定性；7.7.样品在收集、储存、预处理过程中容器的污染样品在收集、储存、预处理过程中容器的污染；8.8.预处理过程尽量简单、尽

27、可能高的精密度和准确度；预处理过程尽量简单、尽可能高的精密度和准确度；9.9.预处理的最后一步应使待测组分富集预处理的最后一步应使待测组分富集；10.10.所选用的分析方法的专属性、灵敏度、分离能力所选用的分析方法的专属性、灵敏度、分离能力8/19/202442体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备1 1 1 1药物理化性质药物理化性质药物理化性质药物理化性质 pKa pKa、亲脂性、挥发性、溶解度、光谱特征、稳定性、亲脂性、挥发性、溶解度、光谱特征、稳定性、血浆蛋白结合率血浆蛋白结合率2 2 2 2浓度范围浓度范围浓度范围浓度范围3 3 3 3测定的目的测定的目的测定的

28、目的测定的目的定性？定量？母体？代谢？定性？定量？母体？代谢？4 4 4 4选用生物样品的种类选用生物样品的种类选用生物样品的种类选用生物样品的种类5 5 5 5样品处理与分析技术的关系样品处理与分析技术的关系样品处理与分析技术的关系样品处理与分析技术的关系 要求要求 专一性、专一性、 灵敏性灵敏性8/19/202443体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备三、常用生物样品预处理技术三、常用生物样品预处理技术o常用生物样品的预处理大致分为常用生物样品的预处理大致分为有机破坏法、有机破坏法、去除蛋白质法、分离纯化与浓集法、缀合物去除蛋白质法、分离纯化与浓集法、缀合物的水解及

29、化学衍生化法的水解及化学衍生化法8/19/202444体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（一）、有机破坏法（一）、有机破坏法1.1.湿法破坏湿法破坏n硝酸硝酸- -高氯酸法；电热消化器法；电热板消化法；高氯酸法；电热消化器法；电热板消化法； 烘箱消化法。烘箱消化法。2.2.干法破坏干法破坏n高温电阻炉灰化法；低温等离子灰化法高温电阻炉灰化法；低温等离子灰化法3.3.氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法以上方法将有机物破坏后，只能进行元素分析，同以上方法将有机物破坏后，只能进行元素分析，同同时应考虑同时应考虑内源性物质的干扰内源性物质的干扰。8/19/202445体内药物分析生物样品与

30、样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（二）、去除蛋白质（二）、去除蛋白质去除蛋白的目的：去除蛋白的目的：1.1.可使可使结合型的药物释放结合型的药物释放出来，以便测定药物出来，以便测定药物的总浓度；的总浓度；2.2.可可预防预防提取过程中提取过程中蛋白质发泡蛋白质发泡，减少乳化的，减少乳化的形成；形成；3.3.可以可以保护仪器保护仪器性能，延长使用期限性能，延长使用期限8/19/202446体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备常用去除蛋白方法常用去除蛋白方法1.1.溶剂解法溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂加入与水相混溶的有机溶剂操操作作简简单单，快快速速，精精密密度

31、度好好，特特别别在在LC-MSLC-MS法法中中常常用用优优点点：与与血血浆浆蛋蛋白白形形成成的的沉沉淀淀致致密密，易易离离心心出出去，且沉淀不会挟带走药物。去，且沉淀不会挟带走药物。局局限限：上上清清液液中中的的微微量量蛋蛋白白可可能能阻阻塞塞HPLCHPLC柱柱，不易挥干浓集。不易挥干浓集。8/19/202447体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备2. 加入中性盐加入中性盐n中中性性盐盐能能将将与与蛋蛋白白质质水水合合的的水水置置换换出出来来，从从而使蛋白质脱水而沉淀。而使蛋白质脱水而沉淀。n常常用用饱饱和和硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、镁镁盐盐、磷磷酸酸盐盐及及枸橼

32、酸盐枸橼酸盐等。等。8/19/202448体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备其他方法其他方法3. 3. 加入强酸加入强酸4. 4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 5. 5. 超滤法超滤法6. 6. 加热法加热法 7. 7. 酶水解法酶水解法 适用条件：适用条件：组织样本或血浆蛋白结合率高的血样组织样本或血浆蛋白结合率高的血样 方法：枯草菌溶素，无需剧烈条件，水解后可有机溶剂方法：枯草菌溶素，无需剧烈条件，水解后可有机溶剂提取。提取。！：不适于在碱性下易水解的药物（！：不适于在碱性下易水解的药物（PH7.0-PH7.0-11.0)11.0)。8/19

33、/202449体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o以上去除蛋白质的方法仅去除了蛋白质（只以上去除蛋白质的方法仅去除了蛋白质（只起到保护色谱柱的作用），但内源性的杂质起到保护色谱柱的作用），但内源性的杂质都在，样品浓度还被稀释。都在，样品浓度还被稀释。基本上不能用光基本上不能用光谱法测定谱法测定。o若用色谱法分离，干扰严重，就得花更多的若用色谱法分离，干扰严重，就得花更多的精力才能分离好。精力才能分离好。o对色谱法来说，它不是好方法。对色谱法来说，它不是好方法。8/19/202450体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（三）分离、纯化与富集（三）

34、分离、纯化与富集o生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物等组成一个极其复加上服用的药物、代谢物等组成一个极其复杂的混合物。杂的混合物。o如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？离出来？o采取的措施：采取的措施：分离、纯化分离、纯化8/19/202451体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备1. 液液-液萃取法（液萃取法（LLE）（liquid-liquid extraction，LLE）原理：原理：多数药物是亲脂性的，多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中在适当的有

35、机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）的水溶性物质（差别）。因而，用有机溶剂萃取一次即可除去大部分因而，用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。定。52体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备采用采用LLE要考虑的几个问题要考虑的几个问题（1 1）溶剂的选择与纯度要求（）溶剂的选择与纯度要求（ARAR以上）以上） 了了解解药药物物与与溶溶剂剂的的化化学学结结构构与与性性质质，按按

36、相相似似相相溶溶原原则则选选用用；对对药药物物的的未未电电离离分分子子可可溶溶，而而对对电电离离形形式式的的分分子子不不溶溶（光光谱谱分分析析法法）；沸沸点点低低、易易挥挥发发、浓浓集集；与与水水不不相相混混溶溶无无毒毒，不不易易燃燃烧烧；不不易易形形成成乳乳化化（氯氯仿仿易易乳乳化化，毒毒性性大大）；具具有有较较高高的的化化学学稳稳定定性性和和惰惰性性；不影响紫外测定（如苯类）不影响紫外测定（如苯类）（毒性大的溶剂尽量不用）（毒性大的溶剂尽量不用）53体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备溶剂名称溶剂名称紫外截止波长紫外截止波长（nm）沸点（沸点（）备注备注极极性性增增

37、加加正己烷正己烷21069环己烷环己烷21081四氯化碳四氯化碳26577肝脏毒性肝脏毒性苯苯28080有致癌性有致癌性甲苯甲苯285111异丙醚异丙醚22068含过氧化物含过氧化物乙醚乙醚23035含过氧化物含过氧化物醋酸戊烯醋酸戊烯285149氯仿氯仿24561肝脏毒性肝脏毒性1,2-二氯乙烷二氯乙烷23083甲基异丁基酮甲基异丁基酮330116醋酸乙酯醋酸乙酯26077正丁醇正丁醇215118液液萃取的溶剂液液萃取的溶剂体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（2）有机溶剂相和水相的体积）有机溶剂相和水相的体积o一般为一般为1111或或2121o由实际情况决定，文献中

38、有的由实际情况决定，文献中有的101101以上以上55体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（3）水相的）水相的pH值值 o主要由药物的主要由药物的pKa决定决定o当当pH与与pKa相相当当时时，50%药药物物以以非非电电离离形形式式存在。存在。n对对于于碱碱性性药药物物，最最佳佳pH值值要要高高于于pKa 1-2单单位位；对于酸性药物，则要低于对于酸性药物，则要低于pKa值值1-2单位。单位。o这这样样就就可可使使90%的的药药物物以以非非电电离离的的形形式式存存在在从而更易溶于有机溶剂中从而更易溶于有机溶剂中示例：示例：如丙戊酸的如丙戊酸的pKa4.95，那么最适宜，

39、那么最适宜pH是？是？8/19/202456体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o但生物样品一般多在碱性下提取。但生物样品一般多在碱性下提取。o因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中内源性物质多是酸性的，在碱性下用样品中内源性物质多是酸性的，在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来8/19/202457体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备2.固相萃取法固相萃取法固相萃取固相萃取(Solid Phase Extraction(Solid Phase Extra

40、ction，SPE)SPE)o是从八十年代中期开始发展起来的一项样品是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。分离，纯化和富集。o主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。灵敏度。58体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备基本原理和方法：基本原理和方法：oSPE SPE 技术基于液技术基于液-

41、 -固相色谱理论，采用选择固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。的色谱过程。o 59体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备o较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂洗脱被测物质，从而达到质，然后用少量溶剂洗脱被测

42、物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。干扰杂质，而让被测物质流出。针管式针管式 抽空减压抽空减压 加压加压 过滤过滤8/19/202460体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备 关于固相萃取小柱：关于固相萃取小柱：a.常常见见的的固固相相萃萃取取柱柱分分为为三三部部分分：医医用用聚聚丙丙烯烯柱柱管管，多多孔孔聚聚丙丙烯烯筛筛板板(20m)和和填填料料(多多为为40-60m，80-100m)。b.常用规格：常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。

43、等。以以100mg/1ml为例：其中为例：其中100mg为填料的质量，为填料的质量，1ml是是空柱管的体积。空柱管的体积。c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。柱通常是一次性使用的。61体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备亲脂性键合相硅胶亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：柱的实验步骤：固相萃取操作一般有五步：固相萃取操作一般有五步：1.1.活化活化甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。创造一定的溶剂环境。2.2.平衡平衡水或适当缓冲液冲洗

44、小柱，水或适当缓冲液冲洗小柱，保持湿润？保持湿润？3.3.上样上样将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液使组分保留在柱上。弃去废液4.4.淋洗淋洗水或缓冲液最大程度除去干扰物。水或缓冲液最大程度除去干扰物。5.5.洗脱洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。收集。62体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备操作步骤操作步骤8/19/202463体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备8/19/202464体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制

45、备SPE优点：优点：1 1、不发生乳化；、不发生乳化；2 2、适应的极性范围较广；、适应的极性范围较广；3 3、提取效率高；、提取效率高；4 4、方便快速；、方便快速；5 5、溶剂用量少；、溶剂用量少；6 6、易于自动化；、易于自动化；7 7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。的药物。65体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备三种方法的优缺点比较66体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备4.固相微萃取法固相微萃取法 类似于气相色谱微量进样器的萃取装置熔融石英纤维上面涂有有机聚合物(如聚二甲基

46、硅氧烷，PDMS) SPME 集萃取、浓缩、进样于一身，极大地提高了分析速度。萃取模式可分为直接固相微萃取和顶空固相微萃取67体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（四）缀合物的水解（四）缀合物的水解尿中药物多数呈缀合状态尿中药物多数呈缀合状态。含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物葡萄糖醛酸苷缀合物； 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成酸形成硫酸酯缀合物硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不由于缀合物较原型药

47、物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解酸水解或酶水解的方法。的方法。68体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备 3 3）溶剂解）溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。2 2）酶水解）酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在可用二者的混和物。一般在pH4.5-7pH4.5-7，3737数数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。小时，条件温和，选择性强，但费用较高。1 1）酸水解）酸水解：0.

48、1N HCl0.1N HCl，100100，30min30min， 条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：69体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备（五）化学衍生化（五）化学衍生化药物分子中含有活泼药物分子中含有活泼H H者均可被化学衍生化，如含者均可被化学衍生化，如含一一COOHCOOH、-OH-OH、-NH-NH2 2、-NH-NH-、-SH-SH等官能团的药物都可被衍生化。等官能团的药物都可被衍生化。 色谱分析是分离分析方法，大部分样品处理后就色谱分析是

49、分离分析方法，大部分样品处理后就可上样分析，但某些药物或代谢物极性大、挥发性可上样分析，但某些药物或代谢物极性大、挥发性低、对热不稳定、与其它物质分离不好或对检测器低、对热不稳定、与其它物质分离不好或对检测器不够灵敏，因此，需要先进行衍生化反应，然后测不够灵敏，因此，需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。定衍生物。70体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备 衍生化反应的特点衍生化反应的特点 （1 1）紫外分光光度法）紫外分光光度法 紫外没有吸收或吸收小的药物紫外没有吸收或吸收小的药物 （2 2）荧光光度法）荧光光度法 不具天然荧光的药物不具天然荧光的药物 （3 3）色色谱

50、谱分分析析法法 极极性性大大、挥挥发发性性低低、热热不不稳稳定定、检检测测灵灵敏敏度度不不够够 A:GCA:GC法中的化学衍生化法法中的化学衍生化法 使极性药物变成非极性的、易挥发使极性药物变成非极性的、易挥发 法的药物；增加药物稳定性；提高光学异构体的分离能力法的药物；增加药物稳定性；提高光学异构体的分离能力 主要衍生化反应主要衍生化反应 硅烷化：硅烷化：R-OHR-OH；R-COOHR-COOH；R-NH-RR-NH-R等极性基团药物等极性基团药物 酰化：酰化：R-OHR-OH；R-NH2R-NH2；R-NH-RR-NH-R等极性基团药物等极性基团药物体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备新技术新技术体内药物分析生物样品与样品制备体内药物分析生物样品与样品制备