免疫组化的原理与操作精选干货

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1、免疫组化的原理与操作概念：概念：免疫免疫组织化学化学(Immunohistochemistry,IHC) 是利是利用抗原抗体反用抗原抗体反应和和组织化学呈色反化学呈色反应来来检测组织和和细胞中某种化学成分的一胞中某种化学成分的一门技技术,是是传统的免疫学和的免疫学和组织化学相化学相结合而合而发展起来的一展起来的一门新新兴学科，也叫学科，也叫原位免疫学（原位免疫学（In situ immunology）。）。特点或特点或优点：点：（1）特异性）特异性强、灵敏度高；、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量）可定性、定位、定量观察；察； （3）将形）将形态学改学改变与功能和代与功能和代谢变化化结 合起

2、来；合起来；免疫免疫组化概述化概述2 IHC不不仅具有具有传统形形态学（包括学（包括LM和和EM水平）能水平）能对组织和和细胞胞进行仔行仔细、客、客观观察的察的优点（特点（特别是是经苏木精或伊木精或伊红复染后），而且复染后），而且还克服了克服了传统免疫免疫学反学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。位的缺点。IHC则可在原位和固相可在原位和固相对染色染色结果果进行行观察。目前察。目前IHC的定位可精确到的定位可精确到亚微微结构水平。构水平。 随着随着IHC技技术的的发展和展和图象分析技象分析技术的的发展，展，IHC已已进入多入多标记（双（双标

3、记）和定量研究的）和定量研究的阶段，使段，使IHC在生物学和医学各在生物学和医学各领域的域的应用日益广泛，不用日益广泛，不仅用于用于研究，也用于研究，也用于诊断。断。IHC与核酸分子与核酸分子杂交相交相结合形成合形成的原位的原位杂交技交技术（in situ hybridization，ISH）既特异既特异性性强、灵敏，又具定位、可、灵敏，又具定位、可视的特点。的特点。3 IHC技技术源于免疫源于免疫荧光光术（immunofluorescence, IF），从），从1941年年1950年年Coons等用了等用了10年首年首创了了 荧光素光素标记抗体技抗体技术检测肺肺组织内的肺炎双内的肺炎双 球菌

4、球菌，六、七十年代，六、七十年代IF在科研中占据着主在科研中占据着主导地位地位1968 年中根一穗（年中根一穗（Nakane）等）等创建了建了酶标抗体技抗体技 术（immunoperoxidase，IPO）铁蛋白蛋白标记 Ab Ab技技术; 1974年年Stemberger Stemberger 改良上述技改良上述技术，建立，建立辣根辣根过氧氧 化物化物酶抗体抗体过氧化物氧化物酶（PAPPAP）技）技术，使免疫，使免疫 细胞化学得到广泛胞化学得到广泛应用用；一、一、IHCIHC的的发展展简史史480年代年代Hsu等建立了等建立了ABCABC法法之后，免疫金之后，免疫金银染色染色 法、半抗原法、

5、半抗原标记法、免疫法、免疫电镜技技术相相继问世。世。 9090年代年代 分子分子杂交技交技术、原位、原位杂交技交技术、免疫、免疫细 胞化学分胞化学分类方法迅速方法迅速发展；展；20002000年年 各种免疫各种免疫组化技化技术更加成熟，使免疫更加成熟，使免疫组 化技化技术成成为当今生物医学中形当今生物医学中形态、功、功 能代能代谢综合合 研究的一研究的一项有力工具。其有力工具。其应用范用范围深达医学各个深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技掌握的基本技 术之一；之一；国内起步晚，从国内起步晚，从70s开始。开始。5（一）方法学（一）方法学1.从从传统

6、的抗原、抗体反的抗原、抗体反应（免疫反（免疫反应）亲和反和反应。新的。新的亲和物和物质对有：有：生物素与卵白素生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌，葡萄球菌A蛋白（蛋白（SPA）与）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。，凝集素与受体，激素与受体。这些些亲和和对亲和力和力强，且可与多种，且可与多种标记物（物（荧光素、光素、酶、同位素、胶、同位素、胶体金、体金、铁蛋白等）蛋白等）结合，由此合，由此产生了生了亲和和组织化学（化学（affinity histochemistry），），这些方法些方法特异性、敏感性、特异性、敏感性、稳定性高，更定性高，更方便、适于某些特殊方便、适于某些

7、特殊观察（如察（如EM）。）。2.从从单一一显示某种物示某种物质（单标记）显示多种物示多种物质（双（双标记）。）。3.从从LMEM（超微（超微结构）：免疫构）：免疫电镜、胶体金法、金、胶体金法、金银法。法。4.从定性从定性定量，定量，图象分析（象分析（IA）、流式）、流式细胞胞术（FCM）。）。5.IHC与与ISH相相结合，可在不同水平合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。6. 原位原位PCR+IHC可在可在组织原位通原位通过扩增增检测微量目的微量目的DNA。7. 趋于于标准化、自准化、自动化。化。二、二、IHCIHC的的现状和状和发展前景展前景6（二）技（二）技术分分类 1.

8、 根据染色方式分成：根据染色方式分成： 贴片染色片染色 漂浮染色漂浮染色 2. 根据根据Ag-Ab结合方式分成：合方式分成： 直接法直接法 间接法接法 多多层法法 3. 按按标记物的性物的性质分成：分成： 免疫免疫荧光技光技术（免疫（免疫荧光法）光法） 免疫免疫酶技技术（酶标抗体法、抗体法、桥法、法、PAD法、法、 ABC法）法） 免疫金属技免疫金属技术（免疫（免疫铁蛋白法、免疫金染色蛋白法、免疫金染色 法、蛋白法、蛋白A金法）金法）7（三）（三）标记物物 1. 必要性：必要性：组织细胞内胞内Ag-Ab结合反合反应一般是不可一般是不可 见的，若在的，若在镜下下检测，则必必须具有可具有可视性性标

9、记物。物。 2. 常用常用标记物物 荧光素光素：最常用的是异硫一：最常用的是异硫一氰酸酸荧光素（光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）-荧光光显 微微镜下呈下呈绿色色荧光光; 四乙基四乙基罗达明（达明（rhodamine RB200）-荧光光显微微镜下下发橙橙红色色荧光光 酶：辣根：辣根过氧化物氧化物酶、碱性磷酸、碱性磷酸酶。 生物素生物素：（：（Biotin） 铁蛋白金蛋白金等：主要等：主要应用于免疫用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及其他：如同位素（因涉及污染和防染和防护难一般不用）一般不用）8（四四）IHC的的应用用1. 只要是形只要是形态科学均可采

10、用科学均可采用:包括病理学、神包括病理学、神经科学、科学、生物学、病原微生物的生物学、病原微生物的检测（病毒、（病毒、细菌、寄生虫菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。等）、皮肤病学、器官移植等。2. 可用于多种材料：可用于多种材料：A.各种各种组织（冰（冰冻组织、formalin固定固定组织、石蜡包埋、石蜡包埋组织兼可）；兼可）；B.各种各种细胞胞(穿刺、穿刺、体液、涂片、血体液、涂片、血细胞、培养胞、培养细胞等）。胞等）。3. 用于用于诊断：断：肿瘤病理学等（大中医院）。瘤病理学等（大中医院）。4. 用于科研：用于科研：临床和基床和基础医学，尤其是形医学，尤其是形态学学专业研研究生常用究生

11、常用IHC，或或IHC+分生技分生技术；最近几年，分子生最近几年，分子生物学研究异常活物学研究异常活跃，但最，但最终还要要归到形到形态上来，用上来，用免疫免疫组织化学方法化学方法对所研究的大分子所研究的大分子进行定位，行定位，进而深入研究其功能。而深入研究其功能。9（一）（一）标本的收集与本的收集与处理理 IHC染色成功与否及其染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身量如何，除染色方法本身外，外，对材料的材料的处理也至关重要，它包括：取材、固理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好目的：保存好Ag的数量的数量及活性、保持及活性、保持组织细胞的良

12、好形胞的良好形态结构。构。材料的来材料的来源：人体及源：人体及实验动物；物；细胞和胞和组织；新；新鲜的及固定的及固定的。的。 1、组织标本的取材与本的取材与储存存 来源：活来源：活检取材、手取材、手术切除、切除、实验动物物组织等。等。 要求：要快、要小（要求：要快、要小（110.4cm），避免），避免挤压。 处理：冰理：冰冻即用或保存；固定即用或保存；固定即用或保存。即用或保存。三、三、样品的准品的准备、处理理10 2、细胞胞标本的取材与本的取材与储存存来源：血来源：血细胞、穿刺胞、穿刺细胞、体液胞、体液细胞等。胞等。处理：理：细胞多胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；直接涂片、干燥、固定、染色

13、； 细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；对于体外培养于体外培养细胞：胞：贴壁生壁生长细胞（内皮胞（内皮C、纤维C、神、神经C等）在培养皿底置等）在培养皿底置载玻片；玻片；悬浮生浮生长细胞胞需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。保存。 11 （二）固定（二）固定（fixation） 1、固定的含、固定的含义 固定是指以某种化学物固定是指以某种化学物质使蛋白使蛋白质、酶类（变性）性）、脂、脂质、糖、糖类等物等物质保持在保持在组织细胞原位，避免胞原位，避免Ag溶解、溶解、扩散、散、丢失；保持失；保持组织细胞的正常形胞

14、的正常形态结构。构。 根据根据Ag对固定固定剂的耐受性，可将其分的耐受性，可将其分为：不不稳定定Ag（如（如细胞表面胞表面Ag，不耐甲，不耐甲醛，宜用丙，宜用丙酮）、）、半半稳定定Ag及及稳定定Ag，后二者多，后二者多为蛋白、蛋白、肽类、酶类物物质。 固定有固定有时间性，太短达不到固定目的，太性，太短达不到固定目的，太长交交联过度，封度，封闭Ag。 12 2、常用固定、常用固定剂及其用途及其用途1. 10%的的formalin（4%的甲的甲醛formaldehyde）：以）：以pH7.4的的PBS配配制，制，优点点：穿透力：穿透力强、固定快、固定快、组织收收缩小；小；适于适于固定蛋白、固定蛋白

15、、肽类、酶、糖。、糖。IHC常用常用4%多聚甲多聚甲醛polyformaldehyde灌注固灌注固定及后固定，定及后固定，时间46 h。2. 2.5%的戊二的戊二醛，同上。也可用，同上。也可用2%戊二戊二醛与与2%多聚甲多聚甲醛混合液混合液固定，尤固定，尤对超微超微结构构保存好。保存好。醛类固定固定剂的缺点是易封的缺点是易封闭抗抗原，必要原，必要时需抗原修复。需抗原修复。3. 70%的酒精（乙醇），的酒精（乙醇），优点点：固定蛋白好，：固定蛋白好，缺点缺点：组织收收缩严重；重；时间：2h。4. 70%丙丙酮，优点点：渗透快；：渗透快；缺点缺点：对形形态保存不好；保存不好；用于用于对冰冰冻切片和

16、切片和细胞涂片的固定；胞涂片的固定；时间：10min。5. 混合固定液：混合固定液：Bouin液：液：40%PF250ml、冰醋酸、冰醋酸50ml、饱和苦味和苦味酸酸250ml；还有有PLP固定液，固定液，较适合免疫适合免疫组化。化。6. 四氧化四氧化锇（OsO4 锇酸）：常用酸）：常用PBS配制配制1%锇酸溶液后固定酸溶液后固定1h，用于免疫，用于免疫组化及化及电镜观察。察。有有强烈刺激，需在通烈刺激，需在通风橱内操橱内操作作。13（三）（三） 组织的脱水、浸蜡、包埋和切片的脱水、浸蜡、包埋和切片 前三步只用于石蜡切片，冰前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振切片和振动切片切片不需此步不需此步骤

17、。 切片可分切片可分为： 石蜡切片石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片57m； 冰冰冻切片切片：浸糖，：浸糖，20%30%蔗糖蔗糖4oC过夜，减少冰夜，减少冰 晶；晶；OCT包埋；液氮速包埋；液氮速冻，减，减轻组织破破 坏。病理切片要薄，坏。病理切片要薄，57 m；脑片通常片通常 3050 m厚。厚。 振振动切片切片：不需做任何包埋，固定后的：不需做任何包埋，固定后的组织可直接可直接 用振用振动切片机做各种厚度的切片，并在切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可染色后可进一步制作一步制作电镜标本本观察。察。 14 （四）防脱片（四）防脱片剂 （1） 蛋白甘油，蛋清

18、与甘油蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、拌、过滤、防腐；、防腐； （2）1%的的铬矾明胶涂片；明胶涂片； （3）0.1%的多聚的多聚赖氨酸涂片，晾干氨酸涂片，晾干备用。用。配制配制时用塑料用塑料 瓶而不能用玻璃瓶瓶而不能用玻璃瓶； （4） 购买商品化的商品化的进口口硅化玻片硅化玻片； （5）APES（氨丙基三乙氧基硅（氨丙基三乙氧基硅烷），），1：50丙丙酮稀稀释， 浸片浸片2030秒，晾干秒，晾干备用；用；贴片片时要一步到位。要一步到位。15（五）抗原修复（五）抗原修复 近年近年兴起的新技起的新技术。目的：。目的：暴露被交暴露被交联封封闭的的Ag。主要适用于主要适用于经长期期formalin固

19、定的固定的标本、石蜡包埋本、石蜡包埋标本；也可用于冰本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：切片。常用的方法有：（1） 微波加微波加热 切片煮沸切片煮沸1020min，室温自然冷却，室温自然冷却，所用溶液有：所用溶液有：饱和和NaCL溶液；溶液；10mMpH 6.0的枸的枸橼酸酸钠缓冲液；冲液； 4M的尿素等；的尿素等；pH8.0TBS;（2）高）高压锅处理理 将切片放入将切片放入10mM、pH 6.0的枸的枸橼酸酸钠缓冲液容器中，置冲液容器中，置锅内加盖内加盖喷气气310min，自然冷，自然冷却。却。（3）酶消化消化处理理 ：常用：常用0.1%的胰蛋白的胰蛋白酶（含（含0.1%CaCL2，pH

20、7.8）37。C 10min。或。或0.4%胃蛋白胃蛋白酶37。C 30min;16 （一）基本染色方法（一）基本染色方法 荧光素光素标记抗体：抗体：FITC、 直接法直接法 TRITC等等标记抗体法抗体法 酶标记抗体：抗体：HRP、AP等等 荧光素光素标记抗体抗体 间接法接法 酶标记抗体（三步法）抗体（三步法） 非非标记抗体法：抗体法：酶桥法、法、PAP法法、APAAP法法; 亲和和组化法：化法：ABC法法、LAB法、法、LsAB法、法、BRAB法法; 双重双重标记：阻断法（酸洗阻断法（酸洗抗）、非阻断法（抗）、非阻断法（连续染）染） 四、四、免疫免疫组织化学技化学技术171直接法直接法 荧

21、光素直接光素直接标记特异性抗体（一抗）上，特异性抗体（一抗）上，标记抗抗体与抗原体与抗原结合（在切片上）合（在切片上）荧光光显微微镜下下观察察检测抗原。抗原。 优点点：简单，时间短，短， 特异性特异性强。缺点缺点：灵敏度低，所：灵敏度低，所 需抗体量大需抗体量大 （不（不经济）。）。应用用：基本不用了！：基本不用了！182间接法接法 荧光素光素标记在二抗上（二抗：抗在二抗上（二抗：抗产生一抗生一抗动物的物的 IgG抗体）。抗体）。显色后色后镜检 特点：特点：1 1、敏感性、敏感性较直接法高直接法高3-43-4倍，但倍，但特异性特异性较低低； 2 2、不必、不必标记每种一抗，只需每种一抗，只需标

22、记某一种某一种动物的二抗；物的二抗； 3 3、一抗可高度稀、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用省一抗，且可用PBSPBS代替一抗做空白代替一抗做空白对照。照。193非非标记Ab桥法：法： “桥法法”是是酶标记抗体的改抗体的改进，经过三次抗体，三次抗体，其二抗其二抗为未未标记桥抗体。抗体。（1）单桥法法20(2)双双桥法法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色可增大染色强度。度。 特特别提示：注意提示：注意动物种属关系物种属关系 特点：特点：敏感性高，但敏感性高，但酶浓度不好掌握；与度不好掌握；与组织非非特异性特异性结合的合的酶不易洗去，背景染色重不

23、易洗去，背景染色重。214 4过氧化物氧化物酶抗抗过氧化物氧化物酶法（法（Peroxidase anti-Peroxidase anti- peroxidase method peroxidase method，简称称PAPPAP法）法） 是是桥法的改良，用第二抗体作法的改良，用第二抗体作“桥梁梁”，先与第一抗体，先与第一抗体结合，合，再与再与PAPPAP复合物复合物联结，形成，形成抗原抗原抗体抗体抗抗IgGIgG抗体抗体PAPPAP复合物复合物，最后用底物，最后用底物显色色剂显色。色。特点：特点：灵敏度高，比灵敏度高，比间接接荧光法敏感光法敏感2020倍，比倍，比间接接酶标记抗体法抗体法敏感

24、敏感100100倍倍22 5亲和素和素-生物素生物素-过氧化物氧化物酶复合物法（复合物法（avidin-biotin- peroxidase complex technique，简称称ABC法）。法）。 关关键的程序步的程序步骤为3步：步： Ag +Ab1 +（Ab2-B）+ABC 复合物复合物 （ Ab2-B 为生物素生物素标记的第二抗体）的第二抗体） （B 为生物素生物素标记的的过氧化物氧化物酶） ABC复合物是复合物是avidin与与酶联biotin 在使用前在使用前30min配配置，混匀。置，混匀。1个个avidin分子分子结合了合了3个个biotin分子，剩下分子，剩下1个个结合点与

25、合点与2抗的生物素抗的生物素结合，合，avidin起起桥联作用。作用。23（1）ABC复合物的制复合物的制备：（2）ABC法反法反应原理：原理：特点：特点：ABC法敏感性更高，比法敏感性更高，比PAP法敏法敏感感2040倍，背景也更清晰。倍，背景也更清晰。24ABC法示意法示意图25染色染色结果果观察察（BrdU）26 6、酶标亲和素和素-生物素技生物素技术（labelled avidin-biotin technique， 简称称LAB法）。法）。 即用辣根即用辣根过氧化物氧化物酶直接直接标记avidin，用，用biotin标记2抗。抗。 关关键步步骤为3步：步： Ag +Ab1 +（Ab2

26、-B）+A （A为HRP标记的卵白素）的卵白素） A与与2抗的生物素抗的生物素结合，合，avidin起起桥联作用。作用。 如将如将该法中的法中的卵白素卵白素（avidin）变换成成链霉卵白素霉卵白素(streptavidin)，LAB法法即成即成LsAB法，或称法，或称SP法法。 据据认为LAB法比法比ABC法敏感法敏感24倍，而倍，而LsAB法因法因链霉卵白素霉卵白素不不与与组织细胞中内源性生物素胞中内源性生物素结合而特异性更高。合而特异性更高。现在在SP法已法已趋于取代于取代ABC法而广法而广为应用。用。27生物素化生物素化抗抗AB复合物复合物酶标链卵白素卵白素AvidinBiotinPe

27、roxidase抗抗组织抗原抗原ABC法（法（3步完成）步完成）LsAB（SP）法（）法（3步完成）步完成）28链霉卵白素霉卵白素酶生物素生物素底物底物抗原抗原SP法示意法示意图29（二）免疫（二）免疫组化染色步化染色步骤（以（以ABCABC法法为例）例）1)、切片常切片常规脱蜡至水：脱蜡至水：二甲苯二甲苯虽然可以反复使用，但次数然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水度是从高到低，与脱水时相反。相反。2)、灭活内源性活内源性酶：博士德推荐博士德推荐应用用3%的双氧水，但的双氧水，但实际操操作中，使用作中，使用30%双氧水和双氧水和纯甲醇按甲醇按1:9的溶的溶剂

28、比混合比混合较为理想。理想。3)、抗原修复：抗原修复：暴露被交暴露被交联封封闭的的Ag 。4)、正常山羊血清封正常山羊血清封闭：封封闭时应该注意室温与注意室温与时间的相的相对关系。室温低，关系。室温低，时间就要就要长一些，反之亦然。另外，保持反一些，反之亦然。另外，保持反应池湿池湿润是重要的一是重要的一环，否，否则，前功尽弃。后面的步，前功尽弃。后面的步骤也是也是如此。如此。5)、一抗反一抗反应：一抗的稀一抗的稀释度、孵育度、孵育时间和温度与染色和温度与染色强度度与背景有直接关系。一般与背景有直接关系。一般说来，阳性染色来，阳性染色强度不度不够时，可提，可提高一抗高一抗浓度和延度和延长孵育孵育

29、时间；背景；背景过高高时则相反。相反。 孵育孵育时间与温度：抗原抗体充分反与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠是得到可靠结果的关果的关键。因此，控制温度与。因此，控制温度与时间也是一个也是一个严肃的的问题。由于室温。由于室温控制控制较为困困难，建建议4冰箱冰箱过夜（夜（18h）。）。306)、二抗（生物素化二抗（生物素化IgG）反）反应：建建议湿盒内湿盒内 37OC1h，另外，另外仪器器显示温度示温度37，但，但实际只有只有23，自然，自然结果果难以令人以令人满意。意。7)、SABC染色（染色（37）：）：这是博士德的人性化之是博士德的人性化之处，直接就可，直接就可以用。以用。8)、DAB显色色

30、镜下控下控时：DAB浓度度应该比推荐的要低一些，比推荐的要低一些，这样可以便于控制反可以便于控制反应时间以及在合适的以及在合适的时候中止反候中止反应。同。同时注意，注意，使用后残余的使用后残余的DAB应妥善妥善处理理，而不是随便倒入下水道，因，而不是随便倒入下水道，因为它有致癌性。它有致癌性。9)、苏木素木素轻度复染：度复染：不建不建议使用。尽管复染后使用。尽管复染后标本本层次分明，次分明，但但实际情况是，情况是，这样有有时也会掩盖阳性也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。果，从而使前功尽弃。10)、脱水透明：脱水透明：脱水乙醇的脱水乙醇的浓度由低到高，有一个度由低到高，有一个较准确判断准确判断脱

31、水成功与否的脱水成功与否的办法是：法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色白色雾状状现象，象，则说明脱水不成功，明脱水不成功，应再次脱水。透明再次脱水。透明时间不要太不要太长，1分分钟左右就可以了。左右就可以了。11)、封片：封片：封片封片时，中性，中性树脂量宜少，同脂量宜少，同时注意不要注意不要产生气泡。生气泡。31（三）免疫（三）免疫组化染色基本技化染色基本技术及注意事及注意事项1实验计划划根据根据课题的内容的内容选用用动物，物，选用配套的用配套的Ab。如。如Ab-I鼠鼠抗人的抗体，与其他种属抗人的抗体，与其他种属间无交叉，无交叉，则不能用其他不能用其他动物

32、，而且物，而且Ab-必必须是羊抗鼠，若是羊抗鼠，若 PAP法法Ab-必必须来来源于鼠，否源于鼠，否则不能不能连接成复合物接成复合物 若要比若要比较染色深浅在染色深浅在对照照组与与实验组间的差的差 异，在异，在贴片方面最好片方面最好贴于同一于同一张载片上，否片上，否则无可比性。无可比性。 选用的用的试剂可靠，可靠，货源充足，随源充足，随时可取。可取。322Ab稀稀释度度 （如系（如系购买的的药盒有工作液和原液）盒有工作液和原液）（1）工作液：无）工作液：无须稀稀释（2）原液：）原液：应参照其提供的工作液参照其提供的工作液浓度度进行行预试验原液的保存（原液的保存（-20）冻存存应选最佳稀度最佳稀度

33、冻存。存。若工作若工作浓度度大于大于1 500则要先将原液稀要先将原液稀释十倍十倍，而，而 后分装后分装10l/瓶瓶冻存（存（-20 ）于）于 冰箱冰箱备用。用。（3）Ab浓度的度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定合需在一定浓度范度范围内内进行，若一方行，若一方过剩剩则形成复合物小且少；形成复合物小且少；极极过剩剩时已形成的复合物亦会解体而呈已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。假阴性。 并非并非Ab浓度越高越好。度越高越好。 333Ab滴片技滴片技术 所滴的抗体所滴的抗体应与切片上的与切片上的组织刚好吻合。好吻合。注意注意滴抗体前需把切片上的水弄干，

34、但不滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。能干片。 要要领：甩：甩净组织周周围的水。的水。344Ab孵育技孵育技术（1）必）必须在在湿盒内湿盒内进行，以防抗体的蒸行，以防抗体的蒸发和干片。和干片。（2）温度与）温度与时间 4过夜（夜（16h） 37 1 h or 参考参考说明明书5光光镜控制控制显色方法色方法（1）室内操作：注意温度与）室内操作：注意温度与时间的关系，室温的关系，室温 最宜最宜5分分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可色可 加深。加深。35 染色失染色失败的几种原因：的几种原因：（1）所染的全部切片均）所染的全部切片均为阴性阴性结果，

35、包括阳性果，包括阳性 对照在内。全部（）原因可能：照在内。全部（）原因可能： 染色未完全染色未完全严格按照操作步格按照操作步骤进行；行； 漏加一种抗体，或抗体失效；漏加一种抗体，或抗体失效； 缓冲液内含叠氮化冲液内含叠氮化钠，抑制了，抑制了酶的活性；的活性； 底物中所加底物中所加H2O2 量少或失效；量少或失效； 复染或脱水复染或脱水剂使用不当使用不当36（2）所有切片均呈阳性反）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：，原因可能是： 切片在染色切片在染色过程中抗体程中抗体过浓，或干燥了。，或干燥了。 缓冲液配置中未加冲液配置中未加氯化化钠和和PH值不准确，不准确， 洗洗涤不不彻底。底。 使用已使用

36、已变色的呈色底物溶液，或呈色反色的呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。 抗体温育的抗体温育的时间过长。 H2O2 浓度度过高，呈色速度高，呈色速度过快。粘附快。粘附剂太太 厚。厚。37（3）所有切片背景所有切片背景过深，原因可能是：深，原因可能是： 未加未加酶消化消化处理切片。理切片。 切片或涂片切片或涂片过厚。厚。 漂洗不漂洗不够。 底物呈色反底物呈色反应过久。久。 蛋白蛋白质封封闭不不够或所用血清溶血。或所用血清溶血。 使用全血清抗体稀使用全血清抗体稀释不不够。（4）阳阳性性对照照染染色色良良好好，检测的的阳阳性性标本本呈呈阴性反阴性反应。 最常最常见的原因是：的原因是：标本的固定和本的固定和处理不当。理不当。3839感感谢您的您的阅览【此课件下载后可自行编辑修改关注我每天分享干货】