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1、实验五淋巴细胞分离与E玫 瑰花环形成实验实验目的熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法学习E花环试验的操作方法观察显微镜下E花环的形态实验原理淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。实验原理分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 实验原理本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差
2、异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。实验原理人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 实验原理T细胞SRBCE受体（CD2)SRBC受
3、体实验器材注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞氏染液绵羊红细胞悬液 （鸡红细胞悬液）、离心机、水浴箱、显微镜等。实验步骤1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中，加等量Hanks液稀释，手动轻轻摇匀； 2.取2ml淋巴细胞分离液加入15 ml离心管中；3.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟，离心后分为4层。5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞（PBMC）层至一刻度离心管内。6.加入5倍以上体
4、积的Hanks液洗涤3次，每次以2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞） 。豚鼠背足静脉取血一人抓住豚鼠，将其左或右后肢膝关节伸直；另一人消毒豚鼠的脚背面并找出背中足静脉，以左手的拇指和食指拉住其趾端；右手持注射器刺入静脉，徐徐抽取血液，达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压迫止血。稀释的血液分离液离心稀释的血液分离液稀释的血浆单个核细胞分层液粒细胞、红细胞外周血单个核细胞（PBMC）主要指T、B淋巴细胞、NK细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，PBMC的分离也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要中间环节。实验步骤5.取一定量的兔血于离心管中，用无Ca、Mg的Hanks液
5、洗涤3次，每次离心1500 rpm5min。将压积RBC配制成1%红细胞悬液。6.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1RBC悬液和0.1ml小牛血清混匀，37水浴15min， 500rpm离心5min，取出.（直接取样，滴加事先滴有美兰染液的载玻片上，计数早期RE花环）7.置于4冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加12滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。8.置于4冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。 实验结果计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算活性E花环形成率，正常值为50%-80%。E花环形成率 形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数 （形成花结+未形成花结）100%分析讨论1.你的实验结果怎样？请加以分析。2.能否用涂片法来观察RE花环形成情况？为什么？
