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1、PCR技术聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点,已广泛应用于分子生物学的各个领域。实验目的:掌握PCR原理,学习PCR操作过程。实验原理:在微量离心管中,加入适量的缓冲液,模板DNA,dNTPs,TaqDNA聚合酶,一对引物,以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环,经过2535次循环,最终使特异区段的DNA扩增数百万倍,满足分子生物学下游操作。成分体积(l)10Buffer(Mg2+free)2.5MgCl2+(25mmol/L)1.5d
2、NTPs(各2.5mmol/L)2引物11引物21Template1TaqDNA聚合酶(1U/L)1dddH2O15PCR扩增反应体系:1.PCR扩增反应体系2.PCR扩增程序设置预变性945变性9430退火6030延伸7240补充延伸72108保存30个循环碱裂解法提取质粒DNA 质粒质粒 (plasmid) 是存在于细菌染色体外的环状双链DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性,与细菌的遗传变异有关。作用:携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,在基因克隆、表达中具有重要作用。基因克隆操作基因克隆操作步骤步骤(五字经)(五字经) 分载体和目的基因的分离切限制性内
3、切酶的应用接载体和目的基因拼接成重组体转重组体的转化筛DNA重组体筛选与鉴定质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的提取过程。实验目的:掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各试剂的作用。实验原理:在碱性环境中,细菌染色体DNA变性分开,而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。1.将1
4、.5ml过夜培养菌液放于EP管中,10000r/min离心1分钟,弃去上清液。2.加100l溶液,剧烈震荡使菌体悬浮均匀,室温放置5分钟。3.加200l溶液(现配现用),轻柔颠倒混匀46次,室温放置5分钟。4.加入150l预冷的溶液,轻柔颠倒混匀46次,冰上放置10分钟。操作过程溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl,pH8.010mmol/LEDTA,pH8.0溶液II:0.2mol/LNaOH1%SDS溶液III:29.4g乙酸钾,11.5ml冰乙酸,H2O至100ml。5.12000r/m离心15分钟(如果上清液仍然浑浊,可将上清液移出,再次离心5分钟)。将上清液转移至EP管中,加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提一次(12000r/min离心10分钟)。6.吸出上清液,加2.5倍体积的无水乙醇,混匀,室温放置10分钟,12000r/min离心10分钟,沉淀DNA。7.70%乙醇洗涤沉淀2次,自然挥干。8.所得DNA溶于3050lTE中,-20保存备用。操作过程TE溶液:10mmol/LTris-Cl,pH8.01mmol/LEDTA,pH8.0实验要求:2人一组,思考实验过程中各种试剂的作用。