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1、PCR的发明，应用现状的发明，应用现状及未来发展趋势及未来发展趋势黄伟达，复旦大学生物化学系黄伟达，复旦大学生物化学系 2004年年12月月3日于杭州博日科技研讨会日于杭州博日科技研讨会1DNA， 生命的蓝图生命的蓝图2故事发生在1983年的春夏之交3Kary B. Mullis (1944 -)，在在Cetus公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了PCR。 他原本是他原本是要合成要合成DNA引物来进行引物来进行测序工作，测序工作， 却常为没有却常为没有足够多的模板足够多的模板DNA而烦而烦恼。恼。1983年春夏之交的年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用
2、别墅的路上萌发了用两个两个两个两个引物引物（而不是一个引物）（而不是一个引物）去扩增模板去扩增模板DNA 的想法的想法.很少有在公司工作的科研人员得很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，诺贝尔奖， Mullis是其中之一是其中之一4Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开的两条链，自己的车和对面开来的车象是来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA， 5Mullis的第一个的第一个PCR实验实验 1983年年9月中旬。月中旬。 Mullis在反应体系中加在反应体系中加 入入DNA聚合酶后在聚合酶后在37
3、 一直保温。结果第二一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。聚合酶进行反应，依次循环。1983年年12月，他终于看到了被同位素标记月，他终于看到了被同位素标记的的PCR条带。条带。6PCR的发展史的发展史1983年春，年春，Mullis发展出发展出PCR的概念；的概念；1983年年9月，月，Mullis用大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个PCR实实验，只用一个循环；验，只用一个循环；1983年年1
4、2月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了10个循环后的个循环后的49 bp长度长度的的第一个第一个PCR片断；片断；1985年年12月月20日，日，Mullis的同事的同事Saiki在在Science上发了一篇论上发了一篇论文，方法中用了文，方法中用了PCR技术，导致技术，导致Mullis的文章到处被拒；的文章到处被拒；1985年年10月月25日申请了日申请了PCR的专利，的专利，1987年年7月月28日批准日批准（专利号（专利号4,683,202 ），这回），这回Mullis是第一发明人。是第一发明人。1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港
5、实验室做专题报告，全世界从此开始学习始学习PCR的方法；的方法；1986年年6月，月，Cetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq DNA polymerase，这是，这是85年春天年春天Mullis建议做的；建议做的；1988年，第一台年，第一台PCR仪问世；仪问世；1991年，年，Hoffman LaRoche以以3亿美元的代价从亿美元的代价从Cetus公司获公司获得全权开发权。得全权开发权。78PCR不只是一个方法改进不只是一个方法改进Mullis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我们要扩我们要扩增这么多增这么多DNA样品有什么用样品有什么用”；到
6、了到了1991，Cetus公司以公司以3亿美元的亿美元的转让费将转让费将PCR相关专利转让给瑞士相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于于1993年获得诺贝尔化学奖，年获得诺贝尔化学奖，PCR和和DNA重组技术一样意义深远。重组技术一样意义深远。9PCR的应用领域10生物学领域几乎无处不用生物学领域几乎无处不用基因、基因、DNA片段的克隆片段的克隆人工基因构建人工基因构建DNA序列测定序列测定基因定点突变基因定点突变基因型（突变）检测，基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析分
7、析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）11医学领域医学领域疾病基因检测疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断遗传病的产前诊断致病病原体的检测致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证法医物证 其他其他: 动、植物检疫动、植物检疫（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（转基因动植物检测）（
8、转基因动植物检测） 12PCR仪器的变迁仪器的变迁三个水浴锅，三个水浴锅， 用手移动用手移动 （Mullis等人当时用的）等人当时用的）电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却 （PE，1988）电加热块电加热块 内置循环液冷却内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块三个加热块 机械手机械手 （Stratagene，1994）半导体制冷和加热半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）温度梯度温度梯度, 荧光检测荧光检测 (如如 Roche的的Lightcycler)风加热风加热Lab-on-chip式的式的PCR仪仪(所谓的芯片所谓的芯片PCR)中国的状况中
9、国的状况中国的状况中国的状况1991年出现三个水浴锅年出现三个水浴锅+机械手的原始机械手的原始PCR仪（华美，复日等）仪（华美，复日等）现在以半导体（现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈上海天呈, 厦门安厦门安普利等）普利等）13耐高温耐高温DNA聚合酶的种类聚合酶的种类Taq DNA聚合酶聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche)Tth DNA聚合酶聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo)Pfu DNA聚合酶聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep
10、 Vent DNA聚合酶聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶聚合酶 （Thermus flavus，Promega)Tli DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche)Pfx DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)Dynazyme DNA聚合酶聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）FD DNA聚合酶聚合酶 (Thermu
11、s sterophilus？，复旦大学？，复旦大学)Tma, Tne, KOD, 14PCR相关的术语和产品层出不穷相关的术语和产品层出不穷T-vectorHotStart TaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRRACEFlow chip PCRTASMultiplex PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRNASBA Recombinant PCR AFLPSSCPIn situ PCRTaqMan/SYBR green15从定性到定量的革命16 PCR 动画动画1 1st
12、st cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过 程程变变变变 性性性性引引引引 物物物物 退退退退 火火火火DNA DNA 复制复制复制复制17PCR产物生成曲线产物生成曲线logDNACycles18PCRPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物最终产物最终产物紫外光观察紫外光观察紫外光观察紫外光观察3-4 3-4 3-4 3-4 小时小时小时小时19PCR具有极高的灵敏度具有极高的灵敏度样品样品正对照正对照 负对照负对照标准分子量标准分子量 污染是污染是污染是污染是PCRPCRPCRPCR实
13、验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实因此，做实因此，做实因此，做实验的时候绝验的时候绝验的时候绝验的时候绝对不要忘了对不要忘了对不要忘了对不要忘了负对照。负对照。负对照。负对照。用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破用紫外灯破坏污染物也坏污染物也坏污染物也坏污染物也是一个办法是一个办法是一个办法是一个办法20logDNAC
14、ycles不同样品有不同的生成曲线不同样品有不同的生成曲线21普通普通PCR和定量和定量PCR的区别的区别适用定性分析，适用定性分析，不适合定量分不适合定量分析；析；PCR 产物的长产物的长度从度从100bp 数数kb实时检测实时检测:每个循每个循环都产出荧光信号环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度绝对定量，灵敏度更高更高 PCR产物的长度一产物的长度一般在般在 60-150 bps22定量定量PCR相关的近年来相关的近年来国际学术刊物上发表的论文数国际学术刊物上发表的论文数1996199719981999200020032003年已年已年已年已经达到经达到经达到经达到30003000篇篇篇篇23
15、Real-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2Molecular Probe公司公司的一个专利的一个专利产品，产品，US Patent5,436,134 1993年年7月月12日申请日申请24SYBR green 的优缺点的优缺点简便简便可以使用已有的引物可以使用已有的引物普遍通用普遍通用可以检测所有的双链可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；扩增；价格价格 $1 / PCR 反应反应定量的灵敏度有所欠缺定量的灵敏度有所欠缺25定量定量 PCR
16、，TaqMan体系体系ABI 公司首先推出公司首先推出(PRISM 7000系列系列) US Patent 5,723,591, 19951995年年1111月申请。月申请。实时检测实时检测: 每个循环都会产生与每个循环都会产生与PCR产产物成正比的荧光物质物成正比的荧光物质26TaqMan系统的一个例子系统的一个例子10ng0.001ngTitrate a template; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng27Taqman的优缺点的优缺点 单一荧光系统中单一荧光系统中不能在同一管中进行多片断扩增不能在同一管中进行多片断扩增 不同的基因必须在不同的试管中不同的基因必须在不
17、同的试管中管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和管之间的精确度跟多荧光系统同等的精确和 可靠可靠灵敏度高，定量方便灵敏度高，定量方便费用高费用高多种荧光提供仪器价格比较贵多种荧光提供仪器价格比较贵28PCR会用于基因身份证的制作吗？29 到到2030年，预计只要年，预计只要1000美美金就能得到个人的基因组序列。金就能得到个人的基因组序列。人与人之间平均人与人之间平均1000个碱基对个碱基对就有一个碱基呈多态性就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共有因此共有300万碱基上可能存在万碱基上可能存在差异差异, 而真正有价值的而真正有价值的SNP也许也许只有只有12万个。万个。 防治基因信息的滥用和基因歧防治基因信息的滥用和基因歧视，将是今后社会的重任。视，将是今后社会的重任。30利用定量利用定量PCR进行进行SNP定型定型3132http:/
