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1、细胞工程（二）一、植物细胞工程（一）、植物细胞工程理论基础（二）、植物细胞的建立与培养（三）、植物细胞大规模培养的步骤（四）、植物细胞培养的细胞生理特性（六）、植物细胞培养的应用（一）、植物细胞工程理论基础及组织培养1 细胞的全能性 细胞的全能性指：即单一的离体细胞在一定的环境条件下能分化成不同细胞组织的乃至整个植株的能力。 动物和植物细胞都可在一定的条件表现出全能性，其中最先发现的是植物细胞的全能性，植物细胞表现全能性要求的条件更容易达到。但不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。植物细胞全能性的差
2、异根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生 组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。P702 细胞分化与脱分化2-1 细胞分化，是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。 它包括：v时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；v空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。v细胞分化是一个复杂的生物化学过程，它是以内部生理生化变化为基础，同时又受到外界条件的调控。据知，营养物质和激素的种类和
3、配比能深刻影响分化过程，光照则是许多细胞分化的必需条件2-2 细胞脱分化与组织培养组织培养(tissue culture)指通过无菌操作分离出植物体的一部分接种到培养基上，在人工控制条件下(包括温度、湿度、光照等)进行培养的过程。外植体(explant)：通常指被培养的上述植物离体部分。p69脱分化：植株上已经分化的细胞或组织离体后在培养条件下逐渐恢复到分生状态的过程。愈伤组织：细胞脱分化的结果通常是形成愈伤组织（未分化的细胞团）。已经脱分化的细胞或组织在一定条件下，它们又可以经过胚状体(由体细胞形成的类似合子胚的结构)或愈伤组织再分化出芽和根，从而发育成一个完整的植株，因为在细胞的基因中，除
4、了全套的结构基因外，还有操纵基因，使结构基因不能启动而无法工作。激素则是在一定条件下能打破操纵基因的控制，使结构基因活化。因此，它直接影响和控制细胞的分化。（二）、植物细胞的建立与培养1、组织培养的基本步骤（1）、试验材料的准备和清洗、消毒等准备试验材料，即一般为植物器官的外植体清除材料内部的微生物不能损害试验材料 （2）、准备培养基培养基是指人工配制的含有营养物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营培养基是指人工配制的含有营养物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营养物质养物质( (大量元素和微量元素大量元素和微量元素) )、碳源、碳源(1%-4%(1%-4%蔗糖蔗糖) )、生长调节剂、生长
5、调节剂(2(2，4-D4-D或或NAANAA、KTKT或或6-BA)6-BA)以及有机附加物以及有机附加物( (维生素、甘氨酸维生素、甘氨酸) )等几类物质组成。等几类物质组成。P7173（3）、接种 在无菌条件下操作，把材料放进培养基（4）、愈伤组织的培养和诱导 愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成。在离体培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织 自然条件下：通过内源生长因子、特别是植物生长素的释放，也能激发细胞分裂产生愈伤组织人工条件下：在生长素（高浓度）和细胞
6、分裂素（低浓度）作用下，外植体经诱导生成愈伤组织。 愈伤组织类型：结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽 结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立（5）、诱导产生器官或体细胞胚 器官产生：愈伤组织形成细胞团器官原基形成器官（先芽后根） 体细胞胚：具有两极性，可一次性再生完整植株。（6 ）、移栽3 植物细胞培养植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过传代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。1 ）愈伤组织的诱导和培养2） 从愈伤组织到细胞株 调节培养基营养组织营养成分组成，愈
7、伤组织在传代培养若干代后，产生细胞群，该细胞群能适应进一步的的悬浮培养，从而建立稳定的悬浮培养植物细胞系1 步骤v选择细胞株，一般选择次生代谢物含量高的植物种类、品种或某一高产植株，利用外植体诱导出愈伤组织。v将愈伤组织转移到液体培养基中，建立悬浮细胞培养株， 并从中筛选出目标产物产量高、性能优良的无性繁殖系。v扩大培养，即把选出的“种子”接种到通气搅拌罐或进一步放大到几百升至几立方米的生物培养器中。（三）植物细胞大规模培养的步骤注意： 由于植物细胞培养的目标产物都属于次级代谢产物，要在细胞生长的后期才开始合成。因此，为了让产物产量高，一般采用二步培养法： 即使用生长培养基使细胞大量增殖，达到
8、了一定的细胞密度，然后再改用适合细胞产物积累的培养基，促进细胞启动 次级代谢途径并提高产物的产量2 培养条件（1）物理因素光：根据植物细胞而定温度：25 左右PH值：56（2）化学因素溶氧：植物细胞悬浮培养是好氧过程，但植物细胞的呼吸率低。选择合适溶氧度培养基：有机碳源、含氮盐类（有时加入有机氮）、植物激素（IAA和2，4D等）（四）、植物细胞培养的细胞生理特性1. 在自然状态下，植物之间通过“细胞间连丝”实现细胞间的联系与接触。这种接触对于细胞悬浮培养同样重要，所以，植物细胞离体悬浮培养需要保持一定的聚集度，适当保持细胞的尺寸。与微生物发酵相比，植物细胞培养需要注意的方面为：细胞尺寸、对剪气
9、力的敏感性，沉降性、生长速率、次级代谢物的合成特点和细菌污染等2. 解决对策剪气力敏感在减少流体剪切力和满足植物细胞良好混合之间的寻求平衡易染菌反应器要加强密封性，防止污染细胞生长与次级代谢产物积累无关联在培养基中分别进行细胞增殖和代谢物积累，或采用固定化物来控制细胞处于只积累目的代谢物的理想状态3. 植物细胞培养工业化存在的问题生长缓慢次级代谢物含量低培养细胞不稳定等多数产物积累于胞内不耐受剪切力一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于1000美元/kg时，才考虑采用植物细胞培养方法。（五）、植物细胞培养的应用1 利用植物细胞培养进行药物生产 太平洋紫杉细胞生产抗癌药物紫杉醇、人参细胞培养人参
10、皂苷和人参多糖、毛地黄细胞培养转化毛地黄毒苷典型案例：紫杉醇生产案例 紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。 1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉，Taxus. brevifolia）树皮中提取出来。该药于1990年进入期临床试验， 1992年底获美国FDA批准上市。 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1
11、KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g 日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。 Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。 清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。 2、利用植物细胞培养生产天然色素典型案例紫草宁紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物
12、，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部 。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只有0.7，生产成本昂贵。紫草宁在国际市场上售价高达7000美元/kgv1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。1v1981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获 得了紫草宁衍生物。v日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。v我 国南京
13、大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进行大量的研究之后得出， 在适当的条件下，培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中 的含量高10倍。 二、转基因植物（一）、转基因生物的概念（二）、转基因植物的构建方法（三）、转基因植物的应用（四）、转基因植物的安全性（一）、转基因生物的概念转基因生物：将一种生物的基因导入另一种生物, 定向改造生物,定向改造生物,使之向着有利于人类需要的方向发展。世界第一例转基因植物烟草1983年在美国问世。1986年,首批转基因植物抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的
14、先河；当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草。（二）、转基因植物构建方法1 农杆菌导入法对象：双子叶植物、部分裸子植物和少数单子叶植物。过程：先将带有目的基因的质粒整合到农杆菌基因组中，再将此农杆菌与植物细胞共同培养3648h，转化植物细胞，然后分离洗涤去菌后通过组织培养获得转基因植物或形成冠瘿瘤和发状根等组织，这些组织也就是一种天然的选择标记。2 基因枪法：金属微粒表面附着含有目的基因的DNA分子，经过加速处理，轰击植物细胞，将DNA直接注射入植物细胞，转化率可达810。3 花粉管通道法：将目的基因整合后，在植株开花时利用花粉管通道直接导入受体植株。4 原生质融合法：去细
15、胞壁植物细胞而得原生质体，然后用带有目的基因的载体去转化此原生质体，再通过筛选，得到转基因植物。（三）、转基因植物的应用1、转基因植物在农业上的应用转基因植物在农业上的应用就是利用生物技术将某些外源生物的基因转移到农作物中去，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质等方面符合人类所需要的方向转变。如果以转基因植物得到的产品为直接食品或原料加工生产的食品就是转基因食品。对于农作物本身，目前直接提高产量还比较困难，主要是构建那些具有抗病、抗虫、抗病毒和抗 除莠剂能力的转基因植物。因为抗性都是有单个基因所控制的。另外，还可改变农产品的质量，比如提高蛋白质中必需氨基酸含量，改变油脂的组成，延
16、长果品的保险期等。1）抗除草剂基因工程。将具有除草作用的酶和蛋白质转进植物，使其拷贝大大增加以除草剂为底物的酶的基因转移到植物中利用基因突变技术使除草剂识别和作用特定位点的氨基酸基因位点突变2）抗虫基因工程：根据抗虫基因的来源，可从细菌中、植物组织中和动物体内分离出相关抗性基因，再转入植物中去。3）抗逆基因工程：包括抗旱、抗寒、抗热和抗盐等方面2. 转基因植物生产药用蛋白质利用转基因植物作为生物反应器生产疫苗，如乙型肝炎表面抗原转基因植物优点：（1）易形成产业化规模；（2）价格便宜；（3）安全；（4）使用方面不足之处：转基因植物中重组蛋白含量低植物外源蛋白的提取和纯化还没有达到产业化水平，还停
17、留在实验室水平。（四）、 转基因植物的安全性 从理论上讲，转基因技术和常规杂交育种都是通过优良基因重组获得新品种的，但常规育种是模拟自然现象进行的，基因重组和交流的范围仅限于种内近缘种间，而转基因技术则可以把任何生物甚至是人工合成的基因转入植物中。人们无法预测将基因转入一个新的遗传背景中会是何种结果，故而产生很多疑虑，主要是关注其食品安全性和生态安全1、食品安全性安全问题I.转基因食品中的外源基因对人体有无毒性II.转基因植物食品中的外源基因是否发生转移III.转基因植物中外源基因编码蛋白对人体是否有害IV.转基因植物食品中的抗生素标记基因编码蛋白是否会使食用者产生抗生素抗药性V.转基因植物中
18、外源基因的次生效应问题2、生态安全性问题转基因植物是否会演变成农田杂草基因漂流到近源野生种的可能性昆虫抗药性的产生本章作业1 简述动物与植物细胞培养过程，并指出二者区别与联系。2 简述转基因食品的利与弊激素：是生物体内特殊组织或腺体产生的，直接分泌到体液中，通过体液运送到特定作用部位，从而引起激动效应（调节控制各种物质代谢和生理功能）的一群微量的有机化合物。植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质。也被成为植物天然激素或植物内源激素。它们在植物体内部分器官合成后转移到其它植物器官，能影响生长和分化。在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，
19、主要由激素控制。在种子休眠时，代谢活动大大降低，也是由激素控制的。 吲哚乙酸（IAA），在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。赤霉素（GA）属于双萜化合物。促进细胞分裂和茎的生长等细胞分裂素（CTK）是一类腺嘌呤衍生物。促进细胞分裂和芽的分化等脱落酸（ABA）是一种倍半萜衍生物。促进休眠等。乙烯是不饱和烃。促进成熟和脱落等细胞激动素是一种植物激素，属细胞分裂素类。具有促进细胞分裂，打破休眠，防止植物纲胞衰老和果实脱落以及解除顶端优势等功能 植物激素等介绍v花粉粒的内壁通过花粉外壁上的萌发孔（或沟）向外伸出的细管。一般每个花粉粒萌发时产生一个花粉管。花粉管是靠其末端生长的，在高倍显微镜下可见花粉管末端有一个透明的半球形区域称帽区。帽区之后的细胞质中含有多种细胞器，这与花粉管的生长有关。花粉管长到一定长度后，原来花粉粒中的内含物全部集中到花粉管的前端，花粉管从柱头经花柱到子房，再进入胚珠及胚囊，将花粉管中的两个精子及全部内含物释放到胚囊中，以便受精作用的进行。花粉管是雄配子体的一部分
