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1、受体研究技术相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!载玻片处
2、理载玻片处理 *组织切片组织切片冰冻切片冰冻切片切片厚度一般为切片厚度一般为 6m ,神经组织的研究要求切片厚度在神经组织的研究要求切片厚度在20-100m最突出的优点是能够较好地保存多种抗原的免疫活性最突出的优点是能够较好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞尤其是细胞表面抗原表面抗原(如膜受体如膜受体)更应采用冰冻切片更应采用冰冻切片.冰冻时注意减少冰晶形成冰冻时注意减少冰晶形成. 石蜡切片石蜡切片其优点是组织结构保存良好其优点是组织结构保存良好, 在病理和回顾性研究中有较大的实用在病理和回顾性研究中有较大的实用价值价值, 能连续切片能连续切片, 组织结构清晰组织结构清晰, 抗原定位准确抗原
3、定位准确. 振动切片振动切片用振动切片机用振动切片机 (Vibratome) , 对新鲜组织对新鲜组织 切片切片, 组织不用固定和冰冻组织不用固定和冰冻,也没有石蜡包埋也没有石蜡包埋.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!免疫组织化学方法免疫组织化学方法 免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学免疫酶组织化学免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理， 先将先将已知的抗体标记上荧光素，已知的抗体标记上荧光素， 再用这种荧光抗体作为探针再用这种荧光抗体作为探针检测细胞内相应的抗原。检测细胞内相应的抗原。
4、(一一) 免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学 由于免疫组织化学的特异性、快速性和在细胞水平定由于免疫组织化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性，位的敏感性与准确性， 免疫荧光组织化学是免疫组织化免疫荧光组织化学是免疫组织化学中广泛应用于受体定位的技术之一学中广泛应用于受体定位的技术之一 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学 分直接法分直接法, 夹心发夹心发, 间接法和补体法间接法和补体法. 其中直接法和间接法最为常用。其中直接法和间接法最为常用。 直接法直接法 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性
5、抗用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞中的抗原相结合，在荧光显微镜下可体，直接与细胞中的抗原相结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光见抗原存在部位呈现特异性荧光. 间接法间接法 先用先用Ab1与与 组织组织Ag结合结合,再用再用标记荧光的标记荧光的Ab2与与Ab1结合结合形成抗原形成抗原-抗体抗体-荧荧光抗体复合物光抗体复合物 染色方法染色方法: BSA封闭封闭-PBS冲洗冲洗-一抗一抗- PBS冲洗冲洗-二抗二抗- PBS冲洗冲洗-(防荧光淬灭封固剂防荧光淬灭封固剂 或或90% 甘油甘油 PBS )封片封片本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球
6、抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!A.用免疫荧光组织化学间接法显示角质细胞生长因子受体用免疫荧光组织化学间接法显示角质细胞生长因子受体(Keratinocytew Growth Factor receptor, KGFR)定位于细胞的细胞膜。定位于细胞的细胞膜。B.在在KGFR抗体孵抗体孵育液中加入过量育液中加入过量KGFR，染色结果为阴性。标尺：，染色结果为阴性。标尺：50um , (Yuan et al. Gastroenterology 2002, 122(Suppl):866) 免疫荧光组织化学间接法免疫荧光组织化学间接法本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您
7、身边的抗体专家!双重免疫荧光染色双重免疫荧光染色 双重免疫荧光染色可在同一组织细胞标本上同时显示两种受体双重免疫荧光染色可在同一组织细胞标本上同时显示两种受体 直接法直接法A 抗体用异硫氢酸荧光素抗体用异硫氢酸荧光素(FITC) 标记标记 B 抗体用得克萨斯红抗体用得克萨斯红 (TR) 或四乙基罗丹名或四乙基罗丹名 (TRITC) 标记标记 按适当比例混合按适当比例混合 一抗标记组织抗原标记组织抗原是目前最广泛应用的双重免疫荧光组织化学技术。所用的一抗必需是来是目前最广泛应用的双重免疫荧光组织化学技术。所用的一抗必需是来自不同种属动物的两种特异性抗体自不同种属动物的两种特异性抗体 (例如：例如
8、：A抗体为多克隆抗体，来自家抗体为多克隆抗体，来自家兔。兔。B抗体为单克隆抗体，来自小鼠抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。二抗为两种不同荧光素标记。二抗为两种不同荧光素标记 (如如 FITC和和TR) 抗产生一抗的不同种属动物的抗产生一抗的不同种属动物的IgG (例如：例如：FITC标记的羊抗标记的羊抗兔兔IgG， TR标记的羊抗小鼠标记的羊抗小鼠IgG)。间接法间接法本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!(二二) 免疫酶组织化学免疫酶组织化学 它是在抗原抗体特异反应存在的前提下，它是在抗原抗体特异反应存在的前提下， 借助酶组织化借助酶组织化学的手段，检
9、测某种物质在组织细胞中的定位：学的手段，检测某种物质在组织细胞中的定位： 即先将抗即先将抗体与酶连接，抗体与组织内特异抗原反应，再借酶对底物体与酶连接，抗体与组织内特异抗原反应，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具一定电子的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成份的定位抗原成份的定位.本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家! 酶催化的底物必须是特异的且易被显示，所形成的产物易酶催化的底物必须是特异的且易被显示，所形成的产
10、物易于光镜或电镜下观察；于光镜或电镜下观察； 所形成的终产物沉淀必须稳定所形成的终产物沉淀必须稳定, 即终产物不能从酶活性部位即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，向周围组织弥散， 影响组织学定位。影响组织学定位。 酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性。酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性。被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物 用于标记的酶应具备以下特点用于标记的酶应具备以下特点本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 (Horsh Radis
11、h Peroxidase, HRP) 具有稳定性强和反具有稳定性强和反应特异高等优点应特异高等优点, 且主要分布于植物中且主要分布于植物中, 是目前应用最多的酶标记物是目前应用最多的酶标记物. 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase, ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 (Glucose Oxidase, GOD)也较为常用也较为常用 最常见的酶标记物最常见的酶标记物 HRP的特异底物为的特异底物为H2O2，在分解，在分解H2O2过程中，与过程中，与H2O2形成复合物形成复合物. 目前应用最为广泛的免疫酶组织化学方法目前应用最为广泛的免疫酶组织化学方法:*过氧化物酶过
12、氧化物酶-抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法 (Peroxidase Antiperoxidase method, PAP 法法) *卵白素卵白素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法 (Avidin Biotin-Peroxidase Complex Method, ABC 法法)本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家! 该方法的基本原理为 PAP 复合物中的抗HRP抗体和第一抗体来自相同种属的动物，特异性一抗与组织细胞中抗原结合，二抗作为桥抗体将过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物(PAP)连接在与组织细胞内抗原结合的一抗上. 过氧化物酶抗过氧
13、化物酶法过氧化物酶抗过氧化物酶法 (PAP 法法) ABC 复合物是将 HRP 连接在生物素上,再将生物素-HRP与卵白素结合而成。 ABC法的基本原理是特异性一抗与组织细胞中抗原结合， 生物素标记的二抗再与一抗结合， ABC复合物中的卵白素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的HRP,最后进行显色定位。 卵白素卵白素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-Peroxidase Complex Method, ABC法法 ).本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!A.用免疫酶组织化学用免疫酶组织化学ABC法显
14、示甲状腺激素受体法显示甲状腺激素受体2在大鼠中缝核神经无细在大鼠中缝核神经无细胞核中的定位。胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲状腺激素受体用免疫前血清代替抗甲状腺激素受体2抗体，所染色结抗体，所染色结果为阴性。标尺：果为阴性。标尺：50um.(YUAN ET AL. brain Research 2000,868:22) 免疫酶组织化学免疫酶组织化学ABC法法本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!第二节第二节 在受体定位中原位杂交组织化学的原理和方法在受体定位中原位杂交组织化学的原理和方法原位杂交组织化学原位杂交组织化学 (In Situ hyb
15、ridization Histochemistry) 是应用带有标记物的已知碱基序列为探针是应用带有标记物的已知碱基序列为探针 (Probe) 与组织、与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影或免交体，然后用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影或免疫组织化学方法在核酸原有的位点进行细胞内定位观察。疫组织化学方法在核酸原有的位点进行细胞内定位观察。 原位杂交组织化学是研究受体的原位杂交组织化学是研究受体的mRNA在特定细胞中表达和在特定细胞中表达和定位的有力工具。定位的
16、有力工具。 许多受体有不同的亚型，有些受体亚型在药理学上仅有非常许多受体有不同的亚型，有些受体亚型在药理学上仅有非常细微的差别。由于不同的亚型由不同的基因编码，检测其相应细微的差别。由于不同的亚型由不同的基因编码，检测其相应的的mRNA可对不同的受体亚型进行鉴别和定位。可对不同的受体亚型进行鉴别和定位。 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!一一 探针探针 常用的有常用的有DNA寡核苷酸探针和酶促合成的寡核苷酸探针和酶促合成的RNA探针探针. DNA寡核苷酸探针设计和合成方法简便寡核苷酸探针设计和合成方法简便,探针序列较短探针序列较短 (一一般为般为
17、30-40 个碱基个碱基)，组织穿透性强，但其敏感性低于，组织穿透性强，但其敏感性低于RNA探针探针. RNA探针由插入到载体中的探针由插入到载体中的cDNA转录而来转录而来,在适当条件下，在适当条件下，可转录可转录cDNA的完整序列的完整序列 ,因此因此RNA探针可耐受非常严格的探针可耐受非常严格的杂交条件，从而获得强杂交信号及低背景的理想结果杂交条件，从而获得强杂交信号及低背景的理想结果. 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!标记探针标记探针 *最常用的标记物为放射性同位素最常用的标记物为放射性同位素3H的分辨力高的分辨力高,能得到良好的细胞定
18、位，但放射自显影时间长，一般需能得到良好的细胞定位，但放射自显影时间长，一般需几周或更长几周或更长 . 32P能量最大能量最大,放射自显影时间较短，仅需几天，但分辨力低放射自显影时间较短，仅需几天，但分辨力低 . 35S标记的探针做原位杂交，其分辨力不及标记的探针做原位杂交，其分辨力不及3H，但明显优于，但明显优于32P，能得到，能得到良好的定位，放射自显影时间约良好的定位，放射自显影时间约10天，比天，比32P长，但比长，但比3H短短. 35S为目前原位杂交放射性标记物中应用最为广泛的一种同位素为目前原位杂交放射性标记物中应用最为广泛的一种同位素 *另一类常见的标记物为地高辛另一类常见的标记
19、物为地高辛 (Digoxingenin) 地高辛分子可被特异性抗体检测地高辛分子可被特异性抗体检测, 方法简便方法简便, 无放射性污染问题无放射性污染问题, 且分辨且分辨力比较高。力比较高。不足之处在于其敏感性较放射自显影低，且定量较为困难不足之处在于其敏感性较放射自显影低，且定量较为困难 .本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!二二 原位杂交组织化学反应原位杂交组织化学反应 1 放射性标记放射性标记RNA 探针的原位杂交探针的原位杂交 *杂交前处理杂交前处理: 杂交前用一系列溶液预处理杂交前用一系列溶液预处理,目的是通过降低探针目的是通过降低探针与
20、组织切片的静电结合，以减低非特异性背景着色与组织切片的静电结合，以减低非特异性背景着色. *杂交反应杂交反应: 温度一般在温度一般在37-420C左右左右 ;过夜杂交过夜杂交; RNA 探针在加入探针在加入到杂交液之前，到杂交液之前， 必需加热至必需加热至800C变性变性, 反应反应10 分钟后，速置于冰上分钟后，速置于冰上. 探针的浓度一般为探针的浓度一般为0.5-5.0g/ml. *杂交后处理杂交后处理: 包括包括RNA酶消化及一系列不同浓度不同温度的盐酶消化及一系列不同浓度不同温度的盐溶液漂洗溶液漂洗. 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!2
21、 放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交 用寡核苷酸探针进行原位杂交，其严格度可高于用寡核苷酸探针进行原位杂交，其严格度可高于RNA探针。原因是探针。原因是寡核苷酸探针较短及寡核苷酸探针较短及 DNA：RNA杂交体的稳定性远低于杂交体的稳定性远低于RNA:RNA杂杂交体。通常杂交温度为交体。通常杂交温度为370C，长于，长于36个碱基的寡核苷酸探针杂交温度个碱基的寡核苷酸探针杂交温度可提高到可提高到420C。杂交温度低，所需的杂交时间要长，通常需过夜。常。杂交温度低，所需的杂交时间要长，通常需过夜。常用探针浓度为用探针浓度为0.5g/ml。 原位杂交组织化学反应的检测
22、方法原位杂交组织化学反应的检测方法 放射自显影检测放射自显影检测 将杂交后的切片将杂交后的切片-浸入核乳胶浸入核乳胶 -取出凉干取出凉干-防入暗盒密封防入暗盒密封-于于 40C冰箱内曝光冰箱内曝光-曝光时间曝光时间 (32P约需约需4-7天，天，3H约需约需2-3月，月，35S约需约需2-4周周 ) 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!用用35S标记的寡核苷酸探针显示谷氨酸脱羧酶标记的寡核苷酸探针显示谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)的两种不同形的两种不同形式式GAD65和和GAD67 mRNA在大鼠内侧
23、脚间核在大鼠内侧脚间核(Endopeduncular Nicleus,EP)的分布的分布. GAD65mRNA的表达在的表达在EP头侧头侧(A)明显高于明显高于EP尾侧尾侧(B)。与。与GAD65相反，相反， GAD67的的mRNA表达表达在在EP头侧头侧(C)明显低于明显低于EP尾侧尾侧(D)。标尺：。标尺：20um.(Yuan et al. Neuroscience 1997,78:87)放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交放射性标记寡核苷酸探针的原位杂交 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!3 地高辛标记的地高辛标记的RNA探针的原位杂交探针的原
24、位杂交 用标准的免疫组织化学检测用标准的免疫组织化学检测,连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体与杂交连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体与杂交体中的地高辛结合，用硝基蓝四唑体中的地高辛结合，用硝基蓝四唑(NBT)作为组织化学的底物进行显色作为组织化学的底物进行显色. 4 原位杂交组织化学与免疫组织化学双重染色法原位杂交组织化学与免疫组织化学双重染色法 双重染色法是先后在同一张切片或相邻切片用原位杂交组织化学和免双重染色法是先后在同一张切片或相邻切片用原位杂交组织化学和免疫组织化学进行染色，在同一细胞同时显示编码某种受体的疫组织化学进行染色，在同一细胞同时显示编码某种受体的mRNA和相和相应的受体或与其共存的其
25、它蛋白质和多肽。应的受体或与其共存的其它蛋白质和多肽。 邻片法可使原位杂交和免疫组化染色都获得理想的结果，易成功，但邻片法可使原位杂交和免疫组化染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。易产生空间误差和样本误差。 同一张切片上进行双重染色法可克服这些误差，但第一次染色总要不同一张切片上进行双重染色法可克服这些误差，但第一次染色总要不同程度地影响第二次染色。同程度地影响第二次染色。 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家! 由于由于mRNA易被染色过程中污染有少量易被染色过程中污染有少量RNA酶的液体所降解，酶的液体所降解，因而实践中往往
26、先进行原位杂交组织化学染色，但对某些较敏感因而实践中往往先进行原位杂交组织化学染色，但对某些较敏感易丢失的蛋白质或生物活性物质，需要先进行免疫组织化学染色，易丢失的蛋白质或生物活性物质，需要先进行免疫组织化学染色，二者须加以平衡考量。二者须加以平衡考量。 在应用双重染色法中，选用的固定剂除了能保持组织细胞良好在应用双重染色法中，选用的固定剂除了能保持组织细胞良好的形态结构，还要同时有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定的形态结构，还要同时有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定剂为剂为4%多聚甲醛多聚甲醛 .本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!用地高辛标
27、记探针进行原位杂交，显示用地高辛标记探针进行原位杂交，显示 KGFFR mRNA在细胞中的定位。在细胞中的定位。A.用反意义链探针杂交显示用反意义链探针杂交显示 KGFFR mRNA定位于细胞质。定位于细胞质。B.用有意义链用有意义链探针杂交，杂交信号明显减少。标尺：探针杂交，杂交信号明显减少。标尺：50um.(Yuan et al. Gastroenterology 2002,122(Suppl):866) 地高辛标记地高辛标记RNA探针原位杂交与免疫组织化学探针原位杂交与免疫组织化学ABC法双重染色法双重染色 本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家
28、!原位杂交组织化学的对照实验原位杂交组织化学的对照实验 *已知阳性组织和已知阴性组织做对照已知阳性组织和已知阴性组织做对照 用探针在已知含靶核酸序列的阳性组织和已知不含靶核酸序列的阴性用探针在已知含靶核酸序列的阳性组织和已知不含靶核酸序列的阴性组织标本上进行杂交，应分别得到阳性结果和阴性结果组织标本上进行杂交，应分别得到阳性结果和阴性结果 *用有意义链用有意义链RNA探针或与靶核酸序列无关的探针做对照探针或与靶核酸序列无关的探针做对照 用标记的有意义链用标记的有意义链RNA探针做原位杂交是证明探针特异性较为理想的阴探针做原位杂交是证明探针特异性较为理想的阴性对照。有意义链性对照。有意义链RNA
29、探针的碱基序列与靶探针的碱基序列与靶mRNA的碱基序列相同，因此，的碱基序列相同，因此，用它做原位杂交应得阴性结果。用它做原位杂交应得阴性结果。 *省去标记探针，结果应为阴性省去标记探针，结果应为阴性 *杂交前用杂交前用RNA酶处理切片，结果应为阴性酶处理切片，结果应为阴性 *用用Northern和和Southern印渍法进一步证实原位杂交结果印渍法进一步证实原位杂交结果 *放射自显影检测系统对照放射自显影检测系统对照*非放射性原位杂交检测系统对照非放射性原位杂交检测系统对照本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!感谢您的浏览本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家!结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！30
