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1、杨柏云杨柏云南昌大学生命科学学院南昌大学生命科学学院第七章植物无病毒苗的培育第七章植物无病毒苗的培育一、植物脱毒研究简史n1889年，印尼的爪哇人发现，患枯萎病的甘蔗放在50-520C的热水中保持30min，可去除枯萎病。n1936年，Kunkel报道患有桃黄萎病(yellowvirus)的植株，在34-360C处理14天可失活。一、植物脱毒研究简史n1943年，white在体外培养感染了烟草花叶病毒（TMV）的马铃薯，并用枯斑寄主法测定了其根不同部位的病毒含量，发现根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存在病毒。随着往成熟区的推移，病毒含量越来越高。n这一发现为茎尖培养脱除病毒提供了理论依据
2、。一、植物脱毒研究简史n1952年，Morel首先从感染了花叶病毒和斑萎病毒的大丽花植株上切取茎尖，通过组织培养首次获得了无病毒的大丽花；n1954年，Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病以后，这一技术即被用于防治许多植物的病毒病。一、植物脱毒研究简史n1960年，Morel培养兰属植物的茎尖，实现了去病毒和快速繁殖二个目的，导致了全世界兰花工业的兴起。n现在茎尖培养脱毒法已经成为植物无毒苗生产中应用最广泛的一种方法。一、植物脱毒研究简史n1972年，Bake研究表明，植物组织在热水中长时间浸泡常常会窒息死亡，并且这种处理也会打破或延长植物的休眠期。所以现在更常用的方法是将病毒感染的植物用
3、3538热空气处理24周或者更长时间进行脱毒。n此法尤其适合处理生理干旱的材料和处于休眠状态的果树。一、植物脱毒研究简史n1984年，认为抗病毒剂主要作用是抑制病毒增殖或移动，但抗病毒剂抑制病毒增殖的机理尚不完全清楚,可能是抑制病毒磷酸盐的合成或者使某些病毒暂时处于无活性状态。 一、植物脱毒研究简史n1994年，-采用不同浓度的病毒唑加入到培养茎尖的培养基中，分别获得了两个百合品种的无毒苗。关于化学疗法在百合脱毒上的应用效果,并在鳞片培养(,1996)和愈伤组织培养(,2000)实验中得到肯定。二、培养无病毒种苗的意义1、病毒对植物外观状态的影响花叶型花叶型： 也称花叶病。是由于叶绿体结团或退
4、化引起。造成叶片上形成暗绿(正常)、亮绿(结团)和黄色(退化)区域。n环斑型环斑型：在叶片、果实或茎的表面形成单线圆纹或同心纹的环、全环或半环，以用连续屈曲状的环，常常和花叶同时发生。二、培养无病毒种苗的意义n畸形生长型畸形生长型：各种反常的生长。n变色型：变色型：叶片的局部或全部颜色改变。如褪绿、变黄、变橙、变红、变紫、变蓝绿等。郁金香碎裂病毒感染郁金香，使其花色由单色发生斑驳或纵向条点。n坏死与变质坏死与变质：某些细胞组织死亡或组织质地变软或变硬或木栓化。黄瓜花叶病毒（CMV） 百合丛簇病（CTLV） 郁金香条斑病毒（TuBV）甘薯羽状斑驳病毒甘薯明脉病毒二、培养无病毒种苗的意义二、培养无
5、病毒种苗的意义番茄黄瓜花叶病毒病症水稻矮缩病症二、培养无病毒种苗的意义n2、病毒对作物产量和品质的影响n病毒的危害给作物生产带来重大的损失。如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产1018%，为害马铃薯有几十种病毒，给马铃薯生产带来严重危害，造成减产30%以上。花卉上病毒的危害大大影响其观赏价值，表现花少而小，产生畸形、变色等。二、培养无病毒种苗的意义二、培育无病毒种苗的意义n靠无性繁殖的作物，如利用茎（块茎、球茎、鳞茎、根茎、匍匐茎），根（块根、宿根）、枝、叶、芽（顶芽、侧芽、球芽、不定芽）等通过嫁接、分株、扦插、压条等途径来进行繁殖的，随着生产栽培时间的延
6、长，危害越来越甚，种类越来越多，危害也就越来越严重。n已报道的植物病毒达500多种，其中，n核果类：1930年5种，1951年48种，1976年95种；n马铃薯：30余种；n苹果：30余种；n柑桔：20多种。n观赏植物病毒：200多种。二、培育无病毒种苗的意义现在离体培育无病毒苗(virus-freeplant)已在生产中发挥重要作用。大蒜经组培脱毒后，蒜头可增产23.3%114.3%，蒜薹增产58.3%175.0%；用脱毒草莓苗进行生产，可提高果实产量20.7%45.5%，果实可溶性固形物含量增加5.3%15.3%；用马铃薯脱毒苗可提高产量30%以上，甚至成倍增长；甘薯增产在20%以上。二、
7、培养无病毒种苗的意义二、培育无病毒种苗的意义n为了提高作物的产量和质量，去除病毒和其它病原菌是非常必要的。虽然通过防治细菌和真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。用组织培养法去除病毒是唯一行之有效的方法。一旦获得了一个不带病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。三、植物快速繁殖的途径和方法n1.无无菌菌短短枝枝型型（微微型型扦扦插插）（节节培培法法）：外植体为单芽的茎段，转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成带一叶的单芽茎段继代又可成苗，这种方法为多数园艺家们所推崇，因为它不经过发生愈伤组织而再生，是最能使无性系后
8、代保持原品种特性的一种繁殖方式。缺点是繁殖系数不高。三、植物快速繁殖的途径和方法n2.丛丛生生芽芽增增殖殖型型：茎尖或初代培养的芽，在适宜的培养基上诱导，不断发生腋芽而成丛生芽，然后再转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。这种从芽到芽，遗传性状稳定，繁殖速度快。三、植物快速繁殖的途径和方法n3.器器官官发发生生型型：从植物叶片、子房、花药、叶柄、胚轴等诱导出愈伤组织，从愈伤组织上诱导不定芽或根来，最后形成再生植株的过程。但可能会发生变异，用于良种繁殖时要注意。三、植物快速繁殖的途径和方法n4.胚胚状状体体发发生生型型：从植物叶子、子房、花药、胚珠、叶柄等诱导体细胞胚胎发生。其发生及成苗过程类
9、似合子胚或种子。这种胚状体具有数量多、结构完整、易成苗和繁殖速度快的特点，是植物离体无性繁殖最快的方法，也是制作人工种子的前提，受到国内外的普遍重视。目前机理尚不清楚，有的还存在一定变异，良繁时要先经过试验后才能在生产上大量应用。n胚状体的发生方式三、植物快速繁殖的途径和方法n5.5.原球茎型：原球茎型：兰科等植物的培养属于这一类型，原球茎（protocorm）是缩短了的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。培养兰花的茎尖或液芽可直接产生原球茎，可以分化成植株，也可以继代增殖产生新的原球茎，这取决于条件和培养基。四、植物脱除病毒的方法n1、热处理法n热处理又称温治疗法(Theomth
10、erapy)。原理是植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。四、植物脱除病毒的方法n（1）热处理方法n温汤浸泡处理：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50左右的温水中浸渍10分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。四、植物脱除病毒的方法n热空气处理：热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在3540。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。四、植物脱除病毒的方法n香石竹于38下处理2个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结
11、合36处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒。四、植物脱除病毒的方法n（2）热处理脱毒法优缺点n优点：优点：n要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。n缺点：缺点：n1、脱毒时间长，脱毒不完全；n2、对球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。n3、热处理后只有一小部分植株能够存活。四、植物脱除病毒的方法n2、茎尖培养脱毒n（1）原理n病毒在植物体内的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点（约0.11.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝
12、传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。四、植物脱除病毒的方法n（2）方法）方法n材料的消毒n茎尖既可来自于大田或是盆栽，也可以来自无菌苗。n来自大田或是盆栽的要进行外植体的消毒，消毒方法则是根据经验灵活运用，与器官培养基本一致。n另外，培养外植体的环境为清洁干净为好，并且给植株定期喷施内吸型杀菌剂（如多菌灵等）或抗生素（如0.1%链霉素）。四、植物脱除病毒的方法n剥取茎尖：n由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有冷光源的解剖镜(840X)。剥离茎尖时，可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。茎尖剥离后，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好。四、植物脱除病
13、毒的方法n操作时，一手用细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带12枚幼叶，然后将其接到培养基上。热处理结合茎尖脱毒培养龙牙百合茎尖茎尖的分化龙牙百合小苗四、植物脱除病毒的方法n接种培养：n接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。n培养温度：22左右的温度；n光照条件：每天16h，光照强度20003000Lx；n茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同，这里不再叙述。四、植物脱除病毒的方法n(3)影响微茎尖培养的因素n外植体大小n在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖
14、的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，而外植体越小脱毒效果越好。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。四、植物脱除病毒的方法n培养条件n由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间有利于茎尖的培养。微茎尖需数月培养才能成功。n外植体的生理状态n茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，在香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中，二者没什么差别。四、植物脱除病毒的方法n(4)茎尖培养的优缺点：n优点优点：n茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较
15、短的时间内得到较多的原种繁殖材料。n缺点：缺点：n技术要求高，植物的存活率低。四、植物脱除病毒的方法n茎尖脱毒培养的两个关键技术环节是茎尖的成活率和脱毒率。褐化是降低茎尖培养成活率的首要因素，褐化的发生与许多因素有关，茎尖大小及受伤程度、取材季节、培养方式、激素浓度、基本培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响，茎尖越小，受伤越多，褐化就越严重，成活率越低。四、植物脱除病毒的方法n在茎尖培养时为抑制褐化的发生，需要优化上述各因子。应用抗氧化剂和也可有效抑制茎尖培养的褐化现象。此外，在茎尖培养基中，应尽量多加些有机营养成分，如水解酪蛋白、水解乳蛋白和椰乳等，有利于茎尖分生组织的培养。小结n剥取的茎
16、尖大小与茎尖的成活率呈正相关系，茎尖越大，成活率越高。茎尖越小，受伤越越多，褐化就越严重，成活率越低。n茎尖大小与脱毒率呈负相关，茎尖越大，脱毒率就越低，茎尖越小，脱毒率就越高。四、植物脱除病毒的方法n马铃薯脱毒快繁图片n龙牙百合脱毒种苗生产图片四、植物脱除病毒的方法n3、抗病毒药剂法n（1）原理n抗病毒剂主要作用是抑制病毒增殖或移动，但抗病毒剂抑制病毒增殖的机理尚不完全清楚,可能是抑制病毒磷酸盐的合成或者使某些病毒暂时处于无活性状态。四、植物脱除病毒的方法n许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：三氮唑核苷（病毒唑），5-二氢尿嘧
17、啶（DHT），双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT），8-氮鸟嘌呤，2-硫脲嘧啶，杀稻瘟抗菌素，放线菌素D，庆大霉素等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY（马铃薯Y病毒）。四、植物脱除病毒的方法n（2）方法：n一是将这些药物常常通过直接注射或喷施到带病毒的植株上。n二是将这些药物加到植株生长的培养基上。n这种方法一般要与茎尖培养相结合应用。经过抗病毒药剂处理的嫩茎，剥取茎尖，再进行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。四、植物脱除病毒的方法n抗病毒剂使用浓度越高，处理时间越长脱毒效果越加明显，相反，高浓度抗病毒剂对植株的生长有一定伤害；病毒抑制剂的使用量，应根
18、据培养的植物种类不同而不同，一般为5mg/L20mg/L之间，另外，添加的浓度高时，处理的时间就可短些，浓度低时，处理的时间就可长些。高浓度的病毒抑制剂不利于茎尖的诱导。四、植物脱除病毒的方法n4、其它脱毒方法n（1）愈伤组织脱毒n原理原理：在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原体。例如已经感染TMV的烟草愈伤组织，经机械分离后，发现仅有40%细胞含有病毒；用感染TMV的烟草髓部愈伤组织诱导出的愈伤组织，继代四次后用荧光抗体法检验，几乎不存在病毒。n产生原因产生原因：一是病毒的复制速度跟不上细胞的增殖速度；二是有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征。四、植物脱除病
19、毒的方法n（2）珠心胚培养脱毒n柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。四、植物脱除病毒的方法n（3）茎尖微体嫁接脱毒n木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难，可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（0.141.0mm），在砧木切断面上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。利用这个方法d桃、柑橘、苹果获
20、得成功。柑橘类嫁接成活率为30%50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。应用这个技术，可获得柑橘类没有银屑病植株、桃树没有洋李环斑病毒、洋李矮缩病毒、褪绿叶斑病毒的无病毒苗。四、植物脱除病毒的方法n小结：n单一的脱毒处理技术或难以完全脱除病毒，或需要较长的时间，2种或3种脱毒技术的组合使用逐渐成为生产无毒种苗的首选。如：将热处理技术与茎尖培养技术或与病毒抑制剂技术相结合，可有效地提高脱毒率。五、脱毒苗的鉴定n1、指示植物鉴定法：n美国病毒学家Holmes于1929年发现，因为是利用病毒在其它植物上产生枯斑作为鉴别病毒种类的标准，也称为枯斑和空斑测定法。n方法：摩擦接种法；嫁接接种法。n
21、局限：只能测出病毒的相对感染力；只能鉴定靠汁液及嫁接传染的病毒。五、脱毒苗的鉴定n利用病毒在其植株上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种专用以产生症状的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。指示植物分为两种类型：一种早接种后产生的症状可扩张到非接种部位；另一种只在接种部位产生病斑。五、脱毒苗的鉴定n接种方法：n接种时取待测植物的幼叶，加少量水及等量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0），磨成匀浆，吸取少量浆液揩抹在事先涂有500600目金刚砂（有利于破损叶片表面细胞）部分，轻轻摩擦务使浆液能侵入叶片表皮细胞但又不损伤叶片。5分钟后用水冲洗叶面。将被接种的指示植物置于有防蚜虫网罩的温室内，15
22、25，如接种植物的浆液含有病毒，数天至几周后，指示植物即出现可见的症状。五、脱毒苗的鉴定n较常用的指示植物有n苋色藜（Chenopodium amaranticolor）、昆诺阿藜(C.quinoa)、n千日红(Gomphrena globosa)和各种烟草等。五、脱毒苗的鉴定n2、抗血清鉴定法n植物病毒是由核酸和蛋白质组成的核蛋白复合体，因而也是一种抗原，注射到动物体内即产生抗体，抗体存在于血清之中，称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有特异性，用特定病毒的抗血清来鉴定该种病毒，具有高度专一性和特异性，几分钟至几小时即可完成，方法简便，所以成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。五、脱毒苗的鉴
23、定n抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，只有获得高纯度的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。抗血清的鉴定法主要根据沉淀反映原理，具体测定有试管沉淀、凝聚试验、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等多种方法。五、脱毒苗的鉴定n3、酶联免疫吸附法(ELISA)：n1997年Clark和Adams用微量血凝板建立了诊断植物病毒的ELISA技术。Casper首先用其测定了PLRV病毒。n原理：是采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。特点：特异性高；
24、测定速度快；灵敏度高；可定量。n五、脱毒苗的鉴定n4、电子显微镜检查法n此法可直接观察到病毒微粒是否存在，病毒颗粒的大小、形态和结构。由于这些特征相当稳定，故对病毒鉴定是很重要的。通常所有的技术包括投影法、背景染色法、表面复形的制备与扫描电镜法，以及超薄切片法。n侵染百合的病毒电镜图六、无病毒植物的保存和利用n1、无病毒苗的保存繁殖n（1）无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好隔离保存。这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用510年。六、无病毒植物的保存和利用n（2）通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.40.5mm大
25、小的网纱，可以防止蚜虫进入。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。六、无病毒植物的保存和利用n（3）有条件的地方可以到海岛或高冷山地种植保存，那里气候凉爽，虫害少，有利于无病毒材料的生长，繁殖。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。六、无病毒植物的保存和利用n2、无病毒苗的利用n无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就
26、可感染。一旦感染，影响产量质量的，就应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。本章小结n1去除植物病毒的方法有热处理法、微茎尖培养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。前两种是主要方法。n2热处理法去除植物病毒可分为温汤浸渍处理法和热处理法。其中后者因不损伤植物材料，因而是目前最为常用的方法。本章小结n3.单一的脱毒处理技术或难以完全脱除病毒，或需要较长的时间，2种或3种脱毒技术的组合使用逐渐成为生产无毒种苗的首选。如：将热处理技术与茎尖培养技术或与病毒抑制剂技术相结合，可有效地提高脱毒率。本章小结n4病毒主要分布于植物体成熟和衰老的组织及器官中，靠维管束传播。由于茎尖尚未形成维管束，所以茎尖一般是无毒的，可用于组织培养无毒苗木。本章小结n5无毒苗的鉴定方法主要有：n（1）指示植物鉴定法；n（2）抗血清鉴定法；n（3）电子显微镜检查法；n（4）酶联免疫鉴定法，是目前比较精确和常用的鉴定方法。
