液质联用LCMS原理简析.pdf

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1、液质联用（LCMS）原理简析 1.质谱法 质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。 质谱的样品一般要汽化，再离子化。不纯的样品要用色谱和质谱联用仪，是通过色谱进样。即色谱分离，质谱是色谱的检测器。离子在电场和磁场的综合作用下，按照其质量数 m 和电荷数 Z 的比值(m/z，质荷比)大小依次排列成谱被记录下来，以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。 2.质谱仪 质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器组成。还包括真空系统、电气系统和数据处理系统等辅助设备。 （1） 离子源： 使样

2、品产生离子的装置叫离子源。 液质的离子源有 ESI，APCI，APPI，统称大气压电离(API)源，实验室常用液质的离子源为ESI 源。 质谱仪由以下几部分组成 数据及供电系统 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 真空系统 电喷雾（ESI）的特点 ? 通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子。 ? 电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和 DNA 等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内 CID）得到化合物的部分结构。 （2）质量分

3、析器： 由它将离子源产生的离子按 m/z 分开。离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。 质量分析器有：磁场和电场、四极杆、离子阱、飞行时间质谱、傅立叶变换离子回旋共振等。实验室目前液质的质量分析器类型：三重四极杆（QqQ） ： 离子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3 ? QqQ 仪器可以方便的改变离子的动能，因此扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定，只能做到单位质量分辨。 ? 在液质联机中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式输送给分子离子，这个能量足以使得

4、处在能量亚稳态分子中的某些化学键断裂并使一些特定的分子发生结构重排。 （3）碰撞诱导解离 CID 质谱： QqQ 检测器中的碰撞反应在 CID 中进行。选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(本实验室选择高纯氦) ，发生离子分子碰撞反应，从而产生子离子 ，再经 MS2的 分 析 器 及 接 受 器 得 到 子 离 子 质 谱 ， 一 般 称 做CID (collision-induced dissociation)谱。 （4）检测器：离子检测器由收集器和放大器组成。打在收集器上的正离子流产生与离子流丰度成正比的信号。 （5）真空系统：质谱仪的离子源、质量分析器和检测器

5、必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)， 扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。实验时要注意观察质谱的真空度状态，如有异常，及时向相关老师汇报。 3. 质谱仪的联用技术 质谱仪可以与其他仪器联用，如气相色谱-质谱联用（GC/MS） 、高效液相色谱-质谱联用 （HPLC/MS） ； 也可以质谱-质谱联用 （MS-MS

6、） 。 （1） GC/MS、HPLC/MS 仪： 基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当， 加之使分离效果好的色谱成为质谱的进样器，而速度快、分离好、应用广的质谱仪作为色谱的鉴定器，使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器。 （2）液质联用与气质联用的区别: ? 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。 ? 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题： 不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；一

7、般没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。 所以目前液质联用在环境领域主要应用于有标准物质参照情况下的定性分析。 （3）MS-MS： 质谱-质谱法是 70 年代后期迅猛发展起来的。这种方法是指用质 谱 作 质 量 分 离 的 质 谱 技 术 (mass separetion-mass spectra characterization)。 它可以研究母离子和子离子的关系，让大的离子进一步裂解，获得裂解过程及离子组成的信息。它有几种称呼，如质谱-质谱法（MS-MS 或 MS/MS）,串联质谱,二维质谱法,序贯质谱。本实验室的质谱检测器为三重四极杆检测器， 属于 MS/MS 型质谱检

8、测器。 （4）有机质谱局限性: ? 异构体，立体化学方面区分能力差。 ? 重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场 NMR，IR等自己动手，须专人操作。 ? 有离子源产生的记忆效应，污染等问题。 ? 价格昂贵，分析成本高，操作复杂。 4. 质谱仪性能指标 (1)质量范围:即仪器测量质量数的范围。 (2)分辨率：即表示仪器分开两个相邻质量离子的能力，通常用 R 表示，实验室内的 TSQ Quantum 分别率为 0.7。 (3)质量测量精度：离子质量测定的精度，一般对质量几百的离子，测量误差应0.003 质量单位。 5.基本术语 (1)质谱图:质谱图一般都采用“条图” ，或称为棒状图。在图

9、中横轴表示质荷比（m/z，因为 Z 接近于 1，故实际上 m/z 多为离子的质量） 。纵轴则表示峰的相对强度(RA,相对丰度)。 (2)质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z。 (3)峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。 (4)离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度。峰越高表示形成的离子越多，也就是说，谱线的强度是与离子的多少成正比的。 (5)基准峰：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰，其离子峰的峰高作为 100%,而以对它的百分比来表示其他离子峰的强度。 (6)总离子流图:在选定的质量范围内， 所有离子强度的

10、总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC 图. (7)质量色谱图:指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图。利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是 LC/MS 测定中最有用的方式。当样品浓度很低时 LC/MS 的 TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入 M+1 或 M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在 LC/MS 上都能反映出来，确定 LC 条件是否合适，以后进行 SRM 等其他扫描方式的测定时可作为参考。 6. 影响离子丰度的主要因素： 峰的强度反映出该碎片离子的多少，峰强表示该种离子多，峰弱表示该种离子少。

11、 影响离子丰度的主要因素：1.键的相对强度：2.产物离子的稳定性：这是影响产物离子丰度的最重要因素。3原子或基团相对的空间排列（空间效应） ：空间因素影响竞争性的单分子反应途径，也影响产物的稳定性。4. Stevenson 规则：5.最大烷基的丢失等。 7质谱中离子的类型 质谱中的离子有多种类型，最基本的有： （1）分子离子 2.03.04.001020304050607080901002.03.04.05.06.00102030405060708090100指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是M+H+ 或M-H-。 在 ESI 中, 有时会生成质量大

12、于分子量的离子如 M+1, M+23, M+39, M+18.称准分子离子,表示为:M+H+,M+Na+等。 分子离子有时又叫母离子，是一切碎片离子的母离子，即一切碎片离子是通过分子离子再进一步裂解得到的。 写质谱裂解反应要从分子离子写起。 （2）碎片离子： ? 准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。 ? 碎片峰的种类、数目及其丰度则与分子结构、仪器类型、分析条件等因素有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。 （3）多电荷离子： 指带有 2 个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些

13、不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。 它的存在说明样品是较稳定的。 （4）同位素离子 由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子. 各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等。 8.扫描模式的选择 （1）正负离子模式: 一般的商品仪器中,ESI 和 APCI 接口都有正负离子测定模式可供选择。一般不要选择两种模式同时进行。 正、负离子模式建议根据文献

14、选择。 选择的一般原则为： ? 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 ? 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。 （2） 全扫描方式（Q1 扫描） 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子， 从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。 （3）母离子扫描 母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物， 尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种

15、扫描功能在药物代谢研究中十分重要。 LC-MS 中常见的本底离子 ? m/z 50-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 ? m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 ? m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 ? m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 ? m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 ? m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子 ? m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 ? m/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24

16、H38O4H+, 391.2843 ? m/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668 ? m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 （3）选择离子扫描（SRM 模式） 也称为子离子扫描（ MS/MS ） ，用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（SRM） 。通过 Q1 选择目标物质的母离子，在 Q2 发生碰撞反应，Q3 对目标物质丰度最大的子离子进行扫描。 子离子质谱图已知只有一种质量通过 MS1（Q1） ，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的， 所以我

17、们更相信由MS/MS 产生的谱图的纯度。相对其它扫描模式，SRM 模式对于目标物质最为灵敏，干扰也最低，一般用于定量分析。 9.其它事项 （1）流动相的选择 ? 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节 pH 值。 ? LCMS 接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲Precursor ion fixed Product ion fixed Fragmentation (CID) 液，含钠和钾的成分必须0.5mmol/l。 （盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙

18、酸）1。含三氟乙酸0.2。 含三乙胺0.5。 含醋酸铵2-5mmol/l。 ? 送样前一定要摸好 LC 条件，能够基本分离，缓冲体系符合 MS要求。 （2）流量和色谱柱的选择 ? 不加热 ESI 的最佳流速是 150ulmin，应用 4.6 mm 内径 LC柱时要求柱后分流， 目前大多采用 l2.1 mm 内径的微柱，TIS源最高允许 lmlmin，建议使用 200400ulmin ? APCI 的最佳流速lmlmin，常规的直径 4.6mm 柱最合适。 ? 为了提高分析效率，常采用 100 mm 的短柱（此时 UV 图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用 MRM 的功能，所以不要求各

19、组分没有完全分离） 。 这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。 （3）辅助气体流量和温度的选择 ? 雾化气（sheath gas）对流出液形成喷雾有影响，辅助气（Aux gas）影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。 ? 操作中温度的选择一般情况下选择温度高于分析物的沸点 20 左右即可。 对热不稳定性化合物， 要选用更低的温度以避免显著的分解。 ? 选用温度和气体流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。 （4）样品的预处理： 从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。 要求获得最佳的分析结果，从 ESI 电离的过程分析：ESI 电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。