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1、1 1、了解尿素、了解尿素 尿素是一种由尿素是一种由C C、H H、O O、N N组成的有机化合物，组成的有机化合物，分子式为分子式为CO(NHCO(NH2 2) )2 2，它是动物体内蛋白质代谢的产物，它是动物体内蛋白质代谢的产物，在肝脏中合成后，随尿液排出。在肝脏中合成后，随尿液排出。 18281828年，德国化学家维勒成功通过无机物的化学年，德国化学家维勒成功通过无机物的化学反应合成了尿素。此后，尿素走向工业化并广泛用于反应合成了尿素。此后，尿素走向工业化并广泛用于农业生产。农业生产。 课题背景课题背景 课题背景课题背景尿素尿素尿素尿素不能直接不能直接不能直接不能直接被农作物被农作物被农
2、作物被农作物吸收。吸收。吸收。吸收。土壤中的某些细菌将土壤中的某些细菌将土壤中的某些细菌将土壤中的某些细菌将尿素尿素尿素尿素分解成氨分解成氨分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、尿素的利用、尿素的利用3 3、细菌能分解尿素的原、细菌能分解尿素的原因因直接原因：能合成脲酶（分解尿素的酶）直接原因：能合成脲酶（分解尿素的酶）根本原因：具有合成脲酶相关的基因根本原因：具有合成脲酶相关的基因两个主要目的：两个主要目的：两个主要目的：两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 课
3、题目的课题目的 科学实例科学实例科学实例科学实例：寻找耐高温的寻找耐高温的DNA聚合酶聚合酶说明：说明：寻找寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的要求，时要根据它对生存环境的要求，到到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。筛选原因：筛选原因：因为热泉的因为热泉的因为热泉的因为热泉的高温高温高温高温条件条件条件条件淘汰了绝大多数微淘汰了绝大多数微淘汰了绝大多数微淘汰了绝大多数微生物生物生物生物，使，使，使，使耐热的耐热的耐热的耐热的TaqTaqTaqTaq细菌保留细菌保留细菌保留细菌保留下来。下来。下来。下来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR)(PCR)是一种在体外将少量是
4、一种在体外将少量DNADNA大量复制的技术，此项技术大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温要求使用耐高温（93930 0C C）的的DNADNA聚合酶。聚合酶。19661966年，布鲁克在美国黄石年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现国家公园的一个热泉中发现了耐热的了耐热的TaqTaq细菌，并分离细菌，并分离到耐高温的到耐高温的DNADNA聚合酶。聚合酶。一、筛选菌株一、筛选菌株耐高温耐高温的酶的酶耐高温耐高温生物体生物体耐高温耐高温环境环境（热泉、火山口）（热泉、火山口）寻找寻找寻找寻找2 2、方法：、方法： 实验室如何筛选菌种实验室如何筛选菌种人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的
5、菌株生长的条件生长的条件(包括营养、温包括营养、温度、度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。1 1、原理：、原理：使用使用选择培养基：选择培养基：允许特定种类的微生物生长，允许特定种类的微生物生长，允许特定种类的微生物生长，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。根据原理，根据原理， 培养基应如何配制，才能将分解培养基应如何配制，才能将分解尿素的细菌分离出来？尿素的细菌分离出来？利用以尿素为唯一氮源的培
6、养基进行筛选利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌株数目：统计菌株数目：统计每克土壤样品中究竟含有多少细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少细菌不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所
7、形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。平板划线法得到的菌落平板划线法得到的菌落 稀释涂布平板法得到的菌落稀释涂布平板法得到的菌落使用使用稀释涂布平板法接种稀释涂布平板法接种，在稀释度足够高的培养基，在稀释度足够高的培养基中，细菌比较分散，容易形成单个菌落。中，细菌比较分散，容易形成单个菌落。 一个菌落一个菌落来源于样品稀释液中的来源于样品稀释液中的一个活菌一个活菌 间接计数法（活菌计数法）间接计数法（活菌计数法）统计菌落数目统计菌落数目每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（C
8、 CV)V)MM C: C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V: V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。 注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择为了保证结果准确，一般选择菌落数在菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。稀释度是不是越高越好？稀释度是不是越高越好？如果稀释度过高，菌落数少于如果稀释度过高，菌落数少于3030，计算结果偏低，计算结果偏低，误差大；如果稀释度过低，菌落数超过误差大；如果稀释度过低，菌落数超过300300，统计，统计和计算结果都会有误差；和计算结果都会有误差；恰当的稀释度
9、恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。是成功统计菌落数目的关键。 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下的培养基中，得到以下两种统计结果。两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，统计三个平板，统计的菌落数分别为的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板上菌，该
10、同学以这三个平板上菌落数的平均值落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布甲：没有重复实验（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。操作过程可能出现了错误。资料分析：资料分析：注意事项注意事项为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂涂布至少三个平板布至少三个平板作为重复组。作为重复组。分析实验结果时，要考虑重
11、复组分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近结果是否接近，如，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔每隔24h24h统计一次菌落数，选取菌落数稳定时的记录统计一次菌落数，选取菌落数稳定时的记录作为结果。作为结果。统计的菌落数往往比活菌实际数目统计的菌落数往往比活菌实际数目低。低。因为当两个或多因为当两个或多个细胞连在一起个细胞连在一起时，繁殖后形成时，繁殖后形成的还是一个菌落的还是一个菌落计数法计数法直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比
12、浊法、膜过滤法膜过滤法三、设置对照三、设置对照1 1、目的：、目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了对照实验是指除了 被测试被测试 的条件外，其他的条件外，其他条件都条件都 相同相同 的实验。的实验。 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为中，从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学两同学分别得到以下两种统计结果。分别得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落
13、。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。也能在该培养基中生长。A A确认自己的操作无误，不确认自己的操作无误，不同的原因是自己所用的土壤样品与其他同学不同，同的原因是自己所用的土壤样品与其他同学不同，但由于自己在实验时未设置对照，因此也拿不出能但由于自己在实验时未设置对照，因此也拿不出能令人信服的证据。请你帮助令人信服的证据。请你帮助A A同学改进实验，提供具同学改进
14、实验，提供具有说明了的证据。有说明了的证据。资料分析：资料分析：小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与方案一：由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：将方案二：将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：如果结果与结果预测：如果结果与A A同学一致，则证明是同学一致，则证明是土样不同引起；如果结果不
15、同，则证明土样不同引起；如果结果不同，则证明A A同学同学的操作有误。的操作有误。土样不同土样不同操作有误导致培养基被污染操作有误导致培养基被污染二二. .实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰
16、旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板三三 样样 品品的稀释的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测
17、测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 185万万，放放线线菌数约为菌数约为477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地
18、提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。. .取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行
19、菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微微生生物物的的
20、培培养养与观察与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？物都是能分解尿素的微生物吗？思考：思考： 不一定。因为有些微生物可以利用不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 课题延伸：鉴定课题延伸：鉴定菌株菌株CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶脲酶脲酶 + H + H2 2OO+ CO+ CO2 22NH2NH3 3原理：原理：产脲酶的细菌将尿素分解成氨，培产脲酶的细菌将尿素分解成氨，培养基养基PHPH会升高，通过检测培养基会升高，通过检测培养基PHPH变化来变化来判断该化学反应是否发生。判断该化学反应是否发生。方法：方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入入酚红指示剂酚红指示剂，培养该细菌，如果，培养该细菌，如果 PHPH升高，升高，指示剂指示剂变红变红，可以初步鉴定该种菌能分解尿，可以初步鉴定该种菌能分解尿素。素。
