《高效液相色谱法12课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法12课件（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第六章第六章 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法(12)课件一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别二、二、HPLC与与GC差别差别三、特点三、特点高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。高效液相色谱法(12)课件一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别主要区别：主要区别：固定相、输液设备和检测手段固定相、输液设备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 柱效低（H，n） 常压输送流动相 分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径 流动相极性
2、极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱； 适于分离极性组分。 反相色谱：反相色谱：固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱； 适于分离非极性组分。高效液相色谱法(12)课件3、流动相：、流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相正相）；反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相）。4、固定相：、固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。5、应用：、应用：既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物。高效液相色谱法(12)课件三、键合相色谱利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面分类：分类：
3、反相键合相色谱：反相键合相色谱：键合固定相极性 流动相极性 高效液相色谱法(12)课件（一）反相键合相色谱（一）反相键合相色谱1、基本原理：、基本原理：疏溶剂理论 键合在硅胶表面的非极性或弱极性基团具有较强的疏具有较强的疏水特性水特性，当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时：一方面，分子中的非极性部分与疏水基团产生缔合作用缔合作用，使它保留在固定相中；另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，并减小保留作用。2、固定相：固定相：非极性烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题）高效液相色谱法(12)课件3、流动相：、流动相：极性大 流动相
4、极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF4、出柱顺序：、出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱5、适用：、适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）高效液相色谱法(12)课件（二）正相键合相色谱（二）正相键合相色谱1、基本原理：、基本原理：利用组分在两相中溶解度的差异溶解度的差异。2固定相：固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：流动相：极性小 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇高效液相色谱法(12)课件4、出柱顺序：出柱顺序：极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱5、适用：、适用
5、：用于分离各类极性化合物。氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离极性稍小的物质氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等高效液相色谱法(12)课件四、凝胶色谱（分子排阻色谱法）1、基本原理：、基本原理：按分子大小分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。高效液相色谱法(12)课件2、固定相：、固定相：采用凝胶。 凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。3、流动相、流
6、动相 必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。高效液相色谱法(12)课件五、离子交换色谱1、基本原理：、基本原理：利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。阴离子交换： 一般形式： R一AB RBA阳离子交换：当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：高效液相色谱法(12)课件2、固定相：、固定相：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分高效液相色谱法(12)课件3、流动相、流动相 离子交换色谱法所用流动相大都
7、是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。 通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。 如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。高效液相色谱法(12)课件六、分离类型的选择 1 1根据相对分子质量选择根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。 标准液相色谱类型（液一固、液一液、离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O2000。 对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。 高效液相色谱法(12)课件2 2根据溶解度选择根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异
8、丙醇中的溶解度是很有用的。 如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳； 如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱； 如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离； 如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。高效液相色谱法(12)课件3 3根据分子结构选择根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色
9、谱。 现列出表作为选择分离类型的参考。 高效液相色谱法(12)课件 表 液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表 溶于水排阻色谱，水为流动相 相对分子质量 2000 不溶于水排阻色谱，非水流动相 同系物分配色谱 不溶于水 异构体吸附色谱样品 分子大小差异排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 2000 排阻色谱，水为流动相 碱阳离子交换色谱 溶于水，可离解 酸阴离子交换色谱 溶于水， 离子与非离子反相离子对色谱 高效液相色谱法(12)课件第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（high performance liquid chromatograph，HPLC）
10、液相色谱仪（液相色谱仪（1）高效液相色谱法(12)课件一、仪器工作流程一、仪器工作流程高压输液系统高压输液系统色谱柱系统色谱柱系统（数据记录处理系统）工作站（数据记录处理系统）工作站进样系统进样系统检测系统检测系统高效液相色谱法(12)课件HPLC的仪器配置及流程色谱泵色谱泵色谱泵色谱泵自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱检测器检测器检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统溶剂溶剂溶剂溶剂高效液相色谱法(12)课件二、主要部件二、主要部件（一（一）高压输液系统高压输液系统1、 贮液器贮液器（1）作用：）作用：提供足
11、够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。（2）要求：）要求：必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液；脱气方便；能耐一定压力；所用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。 高效液相色谱法(12)课件2、 高压输液泵高压输液泵 关键部件之一。（1）作用：）作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。（2）要求：）要求： 泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（3060MPa）下连续工作；输出流量稳定（ 1%），无脉冲，重复性高（ 0.5%） ，而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。（3）类型：）类型：恒压泵、恒流泵。高效液相色谱法(12)课件输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体防止
12、固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气高效液相色谱法(12)课件3、过滤器过滤器（1）作用：）作用：除杂质。（2）类型：）类型： 溶剂过滤器、管道过滤器。高效液相色谱法(12)课件 4、梯度淋洗装置、梯度淋洗装置（1）作用：）作用：缩短时间，使各组分完全分离。（2）类型：）类型：高压梯度：高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度：低压梯度：一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种
13、或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。高效液相色谱法(12)课件流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。（二）（二） 进样系统进样系统高效液相色谱法(12)课件 （三）色谱柱系统（三）色谱柱系统柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径减小填料粒度和柱径以提高柱效。高效液相色谱法(12)课件（四）检测器系统（四）检测器系统1、紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化应用最广，对大部分有机化合物有响应。合物有响应。适于：适于：吸收紫外光的物质。特点：特点：灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm10mm，容积 8
14、L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。高效液相色谱法(12)课件 2、光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。高效液相色谱法(12)课件光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器高效液相色谱法(12)课件 原理：原理：每种物质具有不同的折光指数。可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数折光指数差值，差值与浓度呈正比。特点：特点：灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式
15、和干涉型三种。3、示差折光检测器示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器。除紫外检测器之外应用最多的检测器。高效液相色谱法(12)课件4、荧光检测器荧光检测器适于：适于：只能分析自身发光的物质。特点：特点：高灵敏度、高选择性。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。（五）色谱工作站（五）色谱工作站高效液相色谱法(12)课件操作步骤1)观察流动相流路;2)开电源开关；3)启动泵; 4) 设定压力上、下限;5) 设定分析流速及压力上下限；三、高效液相色谱仪的使用三、高效液相色谱仪的使用高效液相色谱法(12)课件设定流速及压力上设定流速及压力上
16、/下限下限 泵启动停止键电源开关输入信息高效液相色谱法(12)课件6) 设定波长;检测电源开关波长设定键零点调节键输入信息高效液相色谱法(12)课件7)将进样阀手柄上下扳动几次，最后停在INJECT(采样)位置；8)进样分析;9)记录数据与数据处理;10)分析结束后停泵，将进样阀手柄置LOAD位置； 11)停泵；12)关闭电源开关高效液相色谱法(12)课件第三节第三节 高效液相色谱的基本理论高效液相色谱的基本理论和实验技术和实验技术一、速率理论一、速率理论 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即： H=A+ B/u + Cu高
17、效液相色谱法(12)课件1）液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力降低传质阻力是提高柱效主要途径。2）采用粒度小、填充均匀固定相粒度小、填充均匀固定相可提高柱效。3）液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质，恒温恒温。4）采用粘度小、低流速的流动相粘度小、低流速的流动相可降低传质阻力项，提高柱效。高效液相色谱法(12)课件二、实验技术二、实验技术1、溶剂处理技术、溶剂处理技术 （1）溶剂的纯化 色谱纯、分析纯 方法：吸附、蒸馏、萃取、干燥等。 （2）流动相的脱气 方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、在线（真空）脱气装置等。（3）流动相的过滤 方法：0.45m微孔滤
18、膜过滤高效液相色谱法(12)课件2、色谱柱的制备、色谱柱的制备 （1）干法 （2）匀浆填充法3、梯度洗脱技术梯度洗脱技术 改进复杂样品的分离，改善峰形，减少脱尾，缩短分析时间。 高效液相色谱法(12)课件70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响( (梯度淋洗梯度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二
19、甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成使 k 最佳高效液相色谱法(12)课件色谱分离中的问题色谱分离中的问题 由由于于分分析析物物组组成成复复杂杂，以以某某一一组组成成的的流流动动相相可可能能使使部部分分待待测测物物得得到到好好的的分分离离，但但同同时时又又使使其其它它待待测测物物的的分分离离不不令令人人满满意意！实实际际工工作作中中采采用用程程序序升升温温（GC）和和梯梯度度淋淋洗洗（LC）来解决这个问题。来解决这个问题。高效液相色谱法(12)课件4、衍生化技术衍生化技术 紫外-可见衍生化、荧光衍生化5、样品的预处
20、理技术样品的预处理技术 前处理的必要性。 萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。高效液相色谱法(12)课件三、三、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1、固定相与装柱方法的选择：、固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱2、流动相及其流速的选择：、流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3、柱温的选择：柱温的选择： 选室温250C左右高效液相色谱法(12)课件四、定性与定量方法四、定性与定量方法1 1、定性方法、定性方法 （
21、1）利用已知标准品定性 （2）利用检测器的选择性定性 （3）利用紫外检测器全波长扫描功能定性2 2、定量方法、定量方法 （1）归一化法 （2）外标法 （3）内标法高效液相色谱法(12)课件五、五、 HPLCHPLC的应用的应用 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。高效液相色谱法(12)课件2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器高效液相色谱法(12)课件
