黄酮的提取与分离

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1、第三节第三节 提取与分离提取与分离一、提取一、提取 1 1、黄黄酮酮苷苷类类与与极极性性较较大大的的苷苷元元( (羟羟基基黄黄酮酮, ,双双黄黄酮酮, ,橙橙酮酮, ,查查耳耳酮酮等等)丙丙酮酮, ,乙乙酸酸乙乙酯酯, ,乙乙醇醇, ,甲醇甲醇, ,甲醇甲醇- -水水(1:1)(1:1)等提取等提取 2 2、多糖苷类、多糖苷类: : 沸水提取沸水提取 3 3、花色苷类、花色苷类: 0.1% : 0.1% 盐酸提取盐酸提取4 4、黄酮苷元、黄酮苷元: : 氯仿氯仿, ,乙醚乙醚, ,乙酸乙酯等提取乙酸乙酯等提取（一）溶剂萃取法（一）溶剂萃取法1 1、原理：黄酮类化合物与混入杂质极性不同、原理：黄

2、酮类化合物与混入杂质极性不同2 2、举例：、举例：石油醚石油醚 除叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素；除叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素；乙醇乙醇 除蛋白质、多糖类等水溶性杂质。除蛋白质、多糖类等水溶性杂质。（二）碱提取酸沉淀法（二）碱提取酸沉淀法1 1、原理：黄酮类化合物易溶于碱性水。、原理：黄酮类化合物易溶于碱性水。2 2、常用碱液：碳酸钠、常用碱液：碳酸钠, , 氢氧化钠氢氧化钠, , 氢氧化钙氢氧化钙等等 例如：从槐花米提取芦丁过程例如：从槐花米提取芦丁过程 槐花米槐花米加加6 6倍量水倍量水煮沸煮沸以石灰乳调以石灰乳调pH=8-9pH=8-9微沸微沸3030minmin趁热过滤趁热过滤残渣再残

3、渣再水煮一次水煮一次合并两次滤液合并两次滤液 60-70 60-70时以时以浓盐酸调节浓盐酸调节pH=4-5pH=4-5静置静置2424小时小时抽滤抽滤水洗至中性水洗至中性 60 60干燥得粗品芦丁干燥得粗品芦丁沸水重结晶沸水重结晶 70-80 70-80干燥得纯品芦丁。干燥得纯品芦丁。（三）碳粉吸附法（三）碳粉吸附法 1 1、适用范围：主要用于苷类的精制。、适用范围：主要用于苷类的精制。2 2、使用过程：、使用过程： 植物甲醇粗提物植物甲醇粗提物，加入活性炭，检查上清；，加入活性炭，检查上清； 沸水、沸甲醇、沸水、沸甲醇、7%7%酚酚/ /水、水、15%15%酚酚/ /醇洗脱；醇洗脱； 减压

4、浓缩减压浓缩7%7%酚酚/ /水洗脱液至小体积；水洗脱液至小体积； 乙醚除去残留的酚乙醚除去残留的酚 水层中含有较纯的黄酮苷类。水层中含有较纯的黄酮苷类。（四）聚酰胺吸附法（四）聚酰胺吸附法1 1、 聚酰胺对于黄聚酰胺对于黄酮类化合物是比较理想的酮类化合物是比较理想的 吸附剂吸附剂 2 2、洗脱剂：不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水、洗脱剂：不同浓度的乙醇、丙酮以及碱水3 3、分离效果：粗分、分离效果：粗分 例如：银杏叶黄酮的提取例如：银杏叶黄酮的提取 （五）超临界流体萃取法（五）超临界流体萃取法1 1、以、以COCO2 2为单一流体萃取极性较低的游离黄酮或为单一流体萃取极性较低的游离黄酮或黄酮的碳

5、苷类；黄酮的碳苷类；2 2、在在COCO2 2中中加加入入水水、乙乙醇醇等等作作为为夹夹带带剂剂，萃萃取取极极性较高的黄酮或黄酮苷类。性较高的黄酮或黄酮苷类。例例如如：从从甘甘草草中中提提取取黄黄酮酮类类化化合合物物，以以COCO2 2为为单单一流体可萃取极性较低的干草查耳酮一流体可萃取极性较低的干草查耳酮A A、B B；在在COCO2 2- -水水- -乙乙醇醇溶溶剂剂体体系系中中则则可可提提取取极极性性较较高高的的甘草素与异甘草素。甘草素与异甘草素。与活泼型客户相处的原则多微笑说大白话多讲故事，少谈业务多保持一些神秘多提醒他趁热打铁让他多说，你多听与完美型客户交往的原则应表情严肃，衣着正规

6、避免使用肢体语言多提供资料，少说注意你的细节不要夸张，要具体多进行感情上的沟通二、分离二、分离 （一）柱色谱法（一）柱色谱法1. 1. 硅胶柱色谱：硅胶柱色谱： 主主要要适适于于分分离离异异黄黄酮酮、二二氢氢黄黄酮酮、二二氢氢黄黄酮酮醇醇及及高高度度甲甲基基化化（或或乙乙酰酰化化）的的黄黄酮酮及及黄黄酮醇类。酮醇类。 在在加加水水去去活活化化后后可可用用于于分分离离极极性性较较大大的的化化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 硅硅胶胶中中混混存存少少量量金金属属离离子子，应应预预先先用用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 分分离离黄

7、黄酮酮苷苷元元时时，用用氯氯仿仿- -甲甲醇醇混混合合溶溶剂做移动相；剂做移动相； 分分离离黄黄酮酮苷苷时时，用用氯氯仿仿- -甲甲醇醇- -水水或或乙乙酸乙酯酸乙酯- -丙酮丙酮- -水做移动相。水做移动相。2. 2. 聚酰胺柱色谱聚酰胺柱色谱 可用于分离各种类型的黄酮类化合物，可用于分离各种类型的黄酮类化合物， 包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等。包括苷与苷元、查耳酮与二氢黄酮等。 分离的机理分离的机理: : 主要为氢键吸附主要为氢键吸附 ，其吸附，其吸附 强度主要取决于羟基的数目、位置以及溶剂强度主要取决于羟基的数目、位置以及溶剂的影响。的影响。 吸附规律如下吸附规律如下: :a. a.

8、酚羟基数目越多，吸附力越强；酚羟基数目越多，吸附力越强；b. b. 如酚羟基所处位置易形成分子内氢键，如酚羟基所处位置易形成分子内氢键， 则吸附力减小。则吸附力减小。c. c. 分子内芳香程度越高、共轭双键越多，分子内芳香程度越高、共轭双键越多， 则吸附力增强。则吸附力增强。总之，一般吸附力由大到小的顺序为：总之，一般吸附力由大到小的顺序为：黄酮醇黄酮醇 黄酮黄酮 二氢黄酮醇二氢黄酮醇 异黄酮异黄酮 洗脱规律如下洗脱规律如下: :a.a.不同类型黄酮化合物，先后流出顺序为：不同类型黄酮化合物，先后流出顺序为：b.b. 异黄酮异黄酮 二氢黄酮醇二氢黄酮醇 黄酮黄酮 黄酮醇黄酮醇b. b. 相同苷

9、元，洗脱先后顺序为：相同苷元，洗脱先后顺序为： 叁糖苷叁糖苷 双糖苷双糖苷 单糖苷单糖苷 苷元苷元c. c. 母核上增加羟基，洗脱速度即相应下降；母核上增加羟基，洗脱速度即相应下降；d. d. 羟基数目相同时，其位置影响洗脱顺序：羟基数目相同时，其位置影响洗脱顺序： 邻位羟基黄酮邻位羟基黄酮 对位（或间位）羟基黄酮对位（或间位）羟基黄酮 e. e. 查耳酮比相应二氢黄酮难于洗脱。查耳酮比相应二氢黄酮难于洗脱。 f. f. 洗脱能力与介质有关洗脱能力与介质有关 水水 甲醇或乙醇甲醇或乙醇 丙酮丙酮 稀稀NaOHNaOH水水溶液或氨水溶液或氨水 甲酰胺甲酰胺 二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 3 3，5

10、5，7 7，33，4-4-五羟基黄酮五羟基黄酮 3 3，5 5，7 7，33，44，5-5-六六羟羟基基黄黄酮酮 常常用用洗洗脱脱剂剂： 碱碱性性水水溶溶液液、含含盐盐水水溶溶液液、 醇及含水醇等。醇及含水醇等。 其它洗脱溶剂：含水丙酮、甲醇氯仿等其它洗脱溶剂：含水丙酮、甲醇氯仿等（二）梯度（二）梯度pHpH萃取法萃取法1 1、适用范围：酸性强弱不同黄酮苷元的分离。适用范围：酸性强弱不同黄酮苷元的分离。2 2、原理：根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置、原理：根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将总黄不同其酸性强弱也不同的性质，可以将总黄酮溶于有机溶剂后，依次用酮溶于有机溶

11、剂后，依次用5%5%NaHCONaHCO3 3、 5%Na5%Na2 2COCO3 3、0.2%0.2%NaOHNaOH及及4%4%NaOHNaOH水溶液萃取，将黄水溶液萃取，将黄酮按较强酸性至较弱酸性的顺序进行分离。酮按较强酸性至较弱酸性的顺序进行分离。 3 3、分离规律如下：、分离规律如下： 酸性酸性 溶解性溶解性7 7，4-4-二二OH OH 5%5%NaHCONaHCO3 3液液 7- 7-或或4-4-OH OH 5%5%NaNa2 2CO3CO3液液 一般一般OH OH 0.2%0.2%NaOHNaOH液液 5-OH 5-OH 4%4%NaOHNaOH液液（三）根据分子中某些特定官能

12、团进行分离（三）根据分子中某些特定官能团进行分离1 1、铅盐沉淀法：适用于具有邻二酚羟基的分离、铅盐沉淀法：适用于具有邻二酚羟基的分离 具具有有邻邻二二酚酚羟羟基基的的黄黄酮酮成成分分，可可被被中中性性醋醋酸酸铅沉淀；铅沉淀； 不不含含邻邻二二酚酚羟羟基基结结构构的的黄黄酮酮成成分分，可可被被碱碱性性醋酸铅沉淀。醋酸铅沉淀。2 2、硼酸络合法：、硼酸络合法：具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物具有邻二酚羟基的黄酮可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与不含邻二酚羟基结构的易溶于水，借此可与不含邻二酚羟基结构的黄酮成分分离。黄酮成分分离。3 3、脱铅方法、脱铅方法 H H2 2S S法：铅盐沉

13、淀悬浮于乙醇中，通入法：铅盐沉淀悬浮于乙醇中，通入H H2 2S S进行复分解，滤去进行复分解，滤去PbSPbS沉淀，可得黄酮类成分。沉淀，可得黄酮类成分。该法缺点：初生态该法缺点：初生态PbSPbS沉淀具有较高吸附性。沉淀具有较高吸附性。 现通用法：使用硫酸盐或磷酸盐，或使用现通用法：使用硫酸盐或磷酸盐，或使用阳离子交换树脂脱铅。阳离子交换树脂脱铅。 三、提取分离实例三、提取分离实例 从柠檬果皮中分离降血压有效成分从柠檬果皮中分离降血压有效成分 柠柠檬檬果果皮皮2 2kgkg搅搅碎碎热热水水浸浸取取 滤滤液液浓浓缩缩后后加加3 3倍倍量量乙乙醇醇 水水提提取取物物 hexane(hexane

14、(己己烷烷) )提提取取 n-n-BuOHBuOH提提取取n-n-BuOHBuOH提提取取物物加加碱碱式式醋醋酸酸铅铅 黄黄色色铅铅盐盐沉沉淀淀碳碳酸酸氢氢钠钠 滤滤液液66MHClMHCl调调pH=5n-pH=5n-BuOHBuOH提提取取得得粗粗黄黄酮酮类类凝凝胶胶过过滤滤不不同同pHpH水水洗洗 不不同同部部分分反反复复柱柱层层析析反复重结晶反复重结晶得不同单体。得不同单体。 四、含黄酮类化合物中药实例四、含黄酮类化合物中药实例1.1.黄芩黄芩 黄芩苷是黄芩的主要有效成分黄芩苷是黄芩的主要有效成分, ,具有抗菌、具有抗菌、消炎作用。尚有降转氨酶的作用。消炎作用。尚有降转氨酶的作用。 黄芩

15、变绿过程黄芩变绿过程黄芩苷黄芩苷黄芩素（黄色）黄芩素（黄色）绿色绿色2. 2. 槐花米槐花米 芦丁是槐花米的有效成分；芦丁是槐花米的有效成分； 芦丁分子中含有较多酚羟基，显示酸性而芦丁分子中含有较多酚羟基，显示酸性而易溶于碱液中，酸化后又析出。易溶于碱液中，酸化后又析出。第四节第四节 黄酮类化合物的检识与结构鉴定黄酮类化合物的检识与结构鉴定一、黄酮类化合物的检识一、黄酮类化合物的检识 1 1、颜色：、颜色： 黄酮（醇）类黄酮（醇）类黄色；查耳酮黄色；查耳酮橙黄色橙黄色 二氢黄酮（醇）、异黄酮二氢黄酮（醇）、异黄酮无色或微黄色无色或微黄色 2 2、显色反应：、显色反应： 盐酸镁粉、盐酸镁粉、Na

16、BHNaBH4 4、AlClAlCl3 3、醋酸铅等醋酸铅等 （一）纸色谱（一）纸色谱1 1、应用范围：适合于检识各种类型黄酮类化合、应用范围：适合于检识各种类型黄酮类化合物，包括苷与苷元。物，包括苷与苷元。2 2、双双向向纸纸色色谱谱是是检检识识植植物物粗粗提提物物中中黄黄酮酮类类化化合合物存在的最好方法之一。物存在的最好方法之一。 第第一一向向通通常常采采用用一一种种“醇醇性性”溶溶剂剂展展开开，如如 n-n-BuOHBuOH- -HOAcHOAc-H-H2 2O(4:1:5 O(4:1:5 上上 层层 BAW)BAW)、 n-n-BuOHBuOH- -HOAcHOAc-H-H2 2O(3

17、:1:1 O(3:1:1 ， TBA)TBA)与与 水水 饱饱 和和 的的 n-n-BuOHBuOH等；等； 第二向第二向通常用一种通常用一种 “ “水性水性”溶剂展开，溶剂展开， 如如2%2%5%5%HOAcHOAc等等3 3、检识黄酮类苷元：一般用、检识黄酮类苷元：一般用“醇性醇性”展开剂；展开剂； 检识黄酮苷：一般用检识黄酮苷：一般用“水性水性”展开剂。展开剂。4 4、RfRf与黄酮类化合物结构的关系：与黄酮类化合物结构的关系：（1 1）水水性性溶溶剂剂展展开开时时，平平面面型型分分子子几几乎乎停停留留原原点点不不动动( (RfRf0.02);0.70.7） 单糖苷单糖苷 双糖苷双糖苷。

18、（3 3）醇性溶剂展开时，羟基被甲氧基取代，醇性溶剂展开时，羟基被甲氧基取代，因极性减小，因极性减小，RfRf将增大。将增大。（4 4）醇性溶剂展开时，如黄酮类化合物羟基）醇性溶剂展开时，如黄酮类化合物羟基被苷化，因极性增大，被苷化，因极性增大，RfRf将下降。将下降。 5 5、大大部部分分极极性性大大的的黄黄酮酮出出现现在在滤滤纸纸的的右右上上方方，极性小的黄酮则出现在滤纸的左下方。极性小的黄酮则出现在滤纸的左下方。6 6、大大多多数数黄黄酮酮类类化化合合物物在在纸纸色色谱谱上上用用紫紫外外光光灯灯检检查查时时，可可以以看看到到有有色色斑斑点点，以以氨氨蒸蒸汽汽处处理理后后常产生明显的颜色变

19、化常产生明显的颜色变化附：黄酮与黄酮醇的斑点颜色变化附：黄酮与黄酮醇的斑点颜色变化滤纸上斑点颜色滤纸上斑点颜色 可能结构可能结构UVUVUV/NHUV/NH3 3深紫深紫黄或黄绿黄或黄绿（1 1）5-5-OHOH、4-OH4-OH黄酮黄酮（2 2）5-5-OHOH、4-OH 3-OR4-OH 3-OR黄酮醇黄酮醇（3 3）5-5-OHOH、33，4-OH4-OH黄酮黄酮（4 4）5-5-OHOH、34-OH 3-OR34-OH 3-OR黄酮醇黄酮醇亮亮 蓝蓝 色色荧光荧光黄绿或黄绿或 蓝绿色蓝绿色（1 1）无）无5-5-OH OH 黄酮黄酮（2 2）无）无5-5-OH OH 但有但有3-3-O

20、ROR（3 3）无无5-5-OH OH 但有但有33，44双双- -OHOH暗 黄 或橙色无颜色变化无颜色变化（1 1）3-3-OHOH或或5-5-OR OR 黄酮黄酮（2 2）3-3-OHOH、33，4-OH4-OH黄酮醇黄酮醇( (二二) )TLCTLC主要指吸附薄层主要指吸附薄层1 1、硅胶硅胶TLCTLC 用途：分离与鉴定弱极性黄酮类化合物。用途：分离与鉴定弱极性黄酮类化合物。 分离黄酮苷元常用的展开剂：分离黄酮苷元常用的展开剂： 甲苯甲苯- -甲酸甲酯甲酸甲酯- -甲酸（甲酸（ 541 541 ）等。）等。 分离黄酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯分离黄酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯 等

21、中性成分，常用的展开剂是：苯等中性成分，常用的展开剂是：苯- -丙酮丙酮（9191）或苯）或苯- -乙酸乙酯（乙酸乙酯（7.52.57.52.5）等。）等。2 2、聚酰胺、聚酰胺TLCTLC 特点：特别适合于分离含游离酚羟基的特点：特别适合于分离含游离酚羟基的 黄酮及其苷类。黄酮及其苷类。 常用的展开剂：常用的展开剂： 乙醇乙醇- -水（水（3 3：2 2）、丙酮）、丙酮- -水（水（1 1：1 1）、）、 水饱和的正丁醇水饱和的正丁醇- -醋酸（醋酸（100100：1 1）等）等3 3、常用的薄层色谱显色方法、常用的薄层色谱显色方法 1 1）紫外灯下观察；）紫外灯下观察； 2 2）氨蒸气处理

22、后观察颜色变化）氨蒸气处理后观察颜色变化 3 3）2 2 AlClAlCl3 3甲醇溶液甲醇溶液三、紫外可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用三、紫外可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用（一）一般程序：（一）一般程序： 测定样品在甲醇溶液中的测定样品在甲醇溶液中的UVUV光谱；光谱； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后，在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后， 测紫外可见光谱；测紫外可见光谱； 常用的诊断试剂：常用的诊断试剂： 甲醇钠、醋酸钠、醋酸钠甲醇钠、醋酸钠、醋酸钠/ /硼酸、三氯化铝硼酸、三氯化铝以及三氯化铝以及三氯化铝/ /盐酸等盐酸等（二）黄酮类化合物在甲醇溶液中的（二）黄酮类化合物在甲醇溶

23、液中的UVUV特征特征 BenzoylBenzoyl( (苯苯甲酰基甲酰基) ) cinnamoylcinnamoyl( (桂皮酰基桂皮酰基) )( (峰带峰带IIII，220-280nm) 220-280nm) （峰带峰带I I，300-400nm300-400nm） 反映反映A A环取代情况环取代情况 反映反映B B环取代情况环取代情况 1 1、黄酮与黄酮醇类：、黄酮与黄酮醇类： 在在200-400 200-400 nmnm之间都出现两个吸收峰，之间都出现两个吸收峰，二者峰形相似，但带二者峰形相似，但带位置不同，据此分类。位置不同，据此分类。 在黄酮及黄酮醇母核上，如在黄酮及黄酮醇母核上，

24、如7-7-及及4 4 位引位引入羟基、甲氧基等供电子基，将引起相应吸收入羟基、甲氧基等供电子基，将引起相应吸收带红移。带红移。 通常，整个母核上氧取代程度越高，带通常，整个母核上氧取代程度越高，带越向长波方向位移。越向长波方向位移。 带带的峰位主要受的峰位主要受A-A-环氧取代程度的影响；环氧取代程度的影响； B- B-环的取代基对带环的取代基对带的峰位影响甚微，但的峰位影响甚微，但可影响它的形状。可影响它的形状。 如黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷如黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷化时，将引起带化时，将引起带位置紫移；位置紫移； 如黄酮及黄酮醇母核上的羟基被乙酰化了，如黄酮及黄酮醇母核上

25、的羟基被乙酰化了，则原来酚羟基对光谱的影响将完全消除。则原来酚羟基对光谱的影响将完全消除。 2 2、查耳酮及橙酮类、查耳酮及橙酮类共共同同特特征征是是带带很很强强，为为主主峰峰；带带较较弱弱，为次强峰。为次强峰。查查耳耳酮酮中中，带带位位于于220220270270nmnm，带带位位于于340340390390nmnm； 查查耳耳酮酮中中，如如在在环环上上引引入入了了氧氧取取代代基基，也也引引起起带带位位置置红红移移，尤尤其其2-2-位位引引入入- -OHOH时时影影响最大。响最大。 查查耳耳酮酮中中，如如2- 2- OHOH被被甲甲基基化化或或苷苷化化， 则引起带则引起带位置紫移。位置紫移。

26、 橙酮中，常显现橙酮中，常显现3 34 4个吸收峰，但主要吸个吸收峰，但主要吸收峰（带收峰（带）一般位于）一般位于370370430 430 nmnm。 天天然然橙橙酮酮的的带带可可能能出出现现在在370370413 413 nmnm。3 3、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 这三类化合物中，除有由这三类化合物中，除有由A-A-环苯甲酰系统环苯甲酰系统引起的带引起的带吸收外，因吸收外，因B B环不与吡喃酮环上的环不与吡喃酮环上的羰基共轭（或共轭很弱），故带羰基共轭（或共轭很弱），故带很弱，常在很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。主峰的长波方向处有一肩峰。 根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢黄酮及二氢黄酮醇类，前者在黄酮及二氢黄酮醇类，前者在245245270 270 nm nm ，后两者在后两者在270270295295nm nm 。