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1、生化工艺学课件生化工艺学课件第五章第五章 核酸的提取分离核酸的提取分离第五章第五章 核酸的提取分离核酸的提取分离l l5.15.1概述概述概述概述l l5.25.2核酸的理化性质核酸的理化性质核酸的理化性质核酸的理化性质l l5.35.3核酸的作用与用途核酸的作用与用途核酸的作用与用途核酸的作用与用途l l5.45.4动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法l l5.55.5转移因子的制备转移因子的制备转移因子的制备转移因子的制备l l5.65.6辅酶辅酶辅酶辅酶A A的提取的提取的提取的提取l l5.75.7复合辅酶的提取复合辅
2、酶的提取复合辅酶的提取复合辅酶的提取l l5.85.8从啤酒酵母中提取从啤酒酵母中提取从啤酒酵母中提取从啤酒酵母中提取RNARNA5.1概述概述核核酸（酸（nucleicacid)核苷酸核苷酸(nucleotide)磷酸磷酸(phosphoricacid)核苷核苷(nucleoside)戊糖戊糖(pentose)碱碱 基基(base)组成核苷酸的碱基组成核苷酸的碱基Fig. 2-4 The primary structure of DNA. l l脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNADNA）主要存在于细胞核的染色体中，）主要存在于细胞核的染色体中，）主要存在于细胞核的
3、染色体中，）主要存在于细胞核的染色体中，核糖核酸（核糖核酸（核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）主要存在于细胞的微粒体中，各种）主要存在于细胞的微粒体中，各种）主要存在于细胞的微粒体中，各种）主要存在于细胞的微粒体中，各种生物体含有核酸的多少不同生物体含有核酸的多少不同生物体含有核酸的多少不同生物体含有核酸的多少不同l l应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多l l我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，
4、我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，7676个核苷酸，与个核苷酸，与个核苷酸，与个核苷酸，与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力力力力l l呈味呈味呈味呈味核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为是目前国际上流
5、行的新型鲜味剂，其学名为是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为5 5IMPIMP（肌苷酸钠）、（肌苷酸钠）、（肌苷酸钠）、（肌苷酸钠）、5 5GMPGMP（鸟苷酸钠）、（鸟苷酸钠）、（鸟苷酸钠）、（鸟苷酸钠）、I IGG（5050IMPIMP5050GMPGMP），），），）， 我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡肉、鸡蛋、呈味肉、鸡蛋、呈味肉、鸡蛋、呈味肉、鸡蛋、呈味核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种调味调味
6、调味调味料料料料复合而成。复合而成。复合而成。复合而成。l l核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物l l保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲力，还能改善微循环、改善脑机能；
7、促进新陈代谢、抗疲力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。 核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用 ？核酸工业的市场分析核酸工业的市场分析l l核酸药物产品的开发已有近核酸药物产品的开发已有近核酸药物产品的开发已有近核酸药物产品的开发已有近7070年历史。目前，日本是年历史。目前，日本是年历史。目前，日本是年历史。目前，日本是核酸产品的最大生产国，其年产
8、量约核酸产品的最大生产国，其年产量约核酸产品的最大生产国，其年产量约核酸产品的最大生产国，其年产量约75007500吨，约占世吨，约占世吨，约占世吨，约占世界产量的界产量的界产量的界产量的90%90%；西方国家中，意大利也有核酸产品，；西方国家中，意大利也有核酸产品，；西方国家中，意大利也有核酸产品，；西方国家中，意大利也有核酸产品，但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要为调味品。为调味品。为调味品。为调味品。l l我国核酸产品的研究开发起步较早，并
9、取得了令人瞩我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，仅仅仅仅ATPATP一项每年就从日本进口金额达八千万美元一项每年就从日本进口金额达八千万美元一项每年就从日本进口金额达八千万美元一项每年就从日本进口金额达八千万美元 5.2核酸的理化性质核酸的理化性质l l5.2.1核酸的一般性质核酸的一般性质1 1、DNA
10、DNA分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、RNARNA相对分子质量？相对分子质量？相对分子质量？相对分子质量？2 2、DNADNA白色纤维状固体，白色纤维状固体，白色纤维状固体，白色纤维状固体，RNARNA白色粉末，均微溶于水，白色粉末，均微溶于水，白色粉末，均微溶于水，白色粉末，均微溶于水，稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液，溶于乙醇的水溶液，溶于乙醇的水溶液，溶于乙醇的水溶液，乙醇乙醇乙醇乙
11、醇5050（w/ww/w）时，）时，）时，）时，DNADNA析析析析出，出，出，出，当当当当7575时，时，时，时，RNARNA也沉淀出来也沉淀出来也沉淀出来也沉淀出来l l溶解度差别分离溶解度差别分离溶解度差别分离溶解度差别分离101066几千到百万几千到百万几千到百万几千到百万 几万到几百万几万到几百万几万到几百万几万到几百万盐溶液中溶解度差异盐溶液中溶解度差异l提取提取RNA时时NaCl盐溶液浓度仅为盐溶液浓度仅为0.14mol/L即即可可l而提取而提取DNA时，需先用时，需先用0.14mol/LNaCl将将RNA除掉，再继续增加除掉，再继续增加NaCl浓度至浓度至1mol/L时才能够时
12、才能够将将DNA提取出来提取出来5.2.1核酸的一般性质核酸的一般性质3 3、DNADNA极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，pHpH超出超出超出超出5.6-10.95.6-10.9时，相对黏度突然降低时，相对黏度突然降低时，相对黏度突然降低时，相对黏度突然降低4 4、可被可被可被可被酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解成各种组分，用层析、电泳等方法成各种组分，用层析、电泳等方法成各种组分，用层析、电泳等方法成各种组分，用层析、电泳等方法分离，主要利用：分离，主要利用
13、：分离，主要利用：分离，主要利用：RNARNA的磷酸酯键对碱敏感：的磷酸酯键对碱敏感：的磷酸酯键对碱敏感：的磷酸酯键对碱敏感：室温，室温，室温，室温，0.31mol/LKOH0.31mol/LKOH，24h24h，可将，可将，可将，可将RNARNA完全水解，得到完全水解，得到完全水解，得到完全水解，得到2-2-或或或或3-3-核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。DNADNA抗碱水解抗碱水解抗碱水解抗碱水解生理意义生理意义生理意义生理意义：DNADNA更稳定更稳定更稳定更稳定 ，遗传信息。，遗传信息。，遗传信息。，遗传信息。RNARNA是是是是DNADNA的的的的信信
14、信信使使使使，完完完完成任务后迅速降解。成任务后迅速降解。成任务后迅速降解。成任务后迅速降解。5.2.2核酸的紫外吸收性质核酸的紫外吸收性质l l嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环共轭双键共轭双键共轭双键共轭双键紫外吸收，核酸紫外吸收，核酸紫外吸收，核酸紫外吸收，核酸 max max 260nm260nm附近，而附近，而附近，而附近，而 min min 230nm230nm1 1、鉴定纯度、鉴定纯度、鉴定纯度、鉴定纯度纯纯纯纯DNADNA的的的的A A260260/A/A2802801.81.8；纯纯纯纯RNARNA的的的的A A260260/A/A2802802.02.0若溶液
15、中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A A260260/A/A280280 2 2、 含量计算，含量计算，含量计算，含量计算，吸光值为吸光值为吸光值为吸光值为1.001.00时，相当于：时，相当于：时，相当于：时，相当于：50ug/mL50ug/mL双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋DNADNA或：或：或：或：40ug/mL40ug/mL单链单链单链单链DNADNA（或（或（或（或RNARNA）或：或：或：或：20ug/mL20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸lDNA和和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用均在紫外光下有最
16、高吸收峰，可采用OD260nm测定其浓度测定其浓度l另一方面另一方面DNA和和RNA含磷含糖，所以可通过糖含量及含磷含糖，所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量磷含量的测定方法间接表征核酸的含量lRNA所含糖为核糖所含糖为核糖苔黑酚法测定；苔黑酚法测定；lDNA所含糖为脱氧核糖所含糖为脱氧核糖二苯胺法测定。二苯胺法测定。l含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定，纯才能测定，纯RNA含磷量为含磷量为9，而纯，而纯DNA含磷量为含磷量为9.2%。5.2.3核酸的变性和复性核酸的变性和复性 高温（热变性）、酸碱（高温（热变性
17、）、酸碱（高温（热变性）、酸碱（高温（热变性）、酸碱（pHpH小于小于小于小于4 4或大于或大于或大于或大于1111）及某些变性剂）及某些变性剂）及某些变性剂）及某些变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。变成单链，不涉及共价键断裂。变成单链，不涉及共价键断裂。变成单链，不涉及共价键断裂。变性后的理化性质变性后的理化性质DNADNA的变性是爆发式的变性是爆发式的变性是爆发式的变性是爆发式的，变性
18、的，变性的，变性的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发生在一个很窄的温度范围内。粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。二级结构改变，部分失活。二级结构改变，部分失活。二级结构改变，部分失活。260nm260nm吸收值升高。吸收值升高。吸收值升高。吸收值升高。 增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应：在增色效应：在增色效应：在增色效应：在DNADNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大的变性过程中，摩尔吸光系
19、数增大的变性过程中，摩尔吸光系数增大的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在减色效应：在减色效应：在减色效应：在DNADNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。的复性过程中，摩尔吸光系数减小。的复性过程中，摩尔吸光系数减小。的复性过程中，摩尔吸光系数减小。熔解温度（熔解温度（Tm）：）：DNADNA的的的的双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋结结结结构构构构失失失失去去去去一一一一半半半半时时时时对对对对应应应应的温度。的温度。的温度。的温度。 浓浓浓浓 度度度度 50ug/mL50ug/mL时时时时 ， 双双双双 链链链链 DNADNA A A260260=1.00=1.00；完全变性（单链）完全变性（单
20、链）完全变性（单链）完全变性（单链）A A260260=1.37=1.37 当当当当A A260260增增增增加加加加到到到到最最最最大大大大增增增增大大大大值值值值一一一一半半半半时时时时，即即即即1.1851.185时，对应的温度即为时，对应的温度即为时，对应的温度即为时，对应的温度即为T Tmm。DNADNA的的的的T Tmm一般在一般在一般在一般在82958295之间之间之间之间影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素1 1、DNADNA均一性均一性均一性均一性 ：均一性高，变性的温度范围越窄，据均一性高，变性的温度范围越窄，据均一性高，变性的温度范围越窄，据均一性高，变性的温度范围越窄
21、，据此可分析此可分析此可分析此可分析DNADNA的均一性的均一性的均一性的均一性 。2 2、G-CG-C含量含量含量含量与与与与T Tmm值成正比（值成正比（值成正比（值成正比（whywhy？）：测定）：测定）：测定）：测定T Tmm，可推知，可推知，可推知，可推知G-CG-C含量。含量。含量。含量。G-C%=G-C%=（T Tmm-69.3-69.3）2.442.443 3、介质中离子强度：、介质中离子强度：、介质中离子强度：、介质中离子强度：离子强度高，离子强度高，离子强度高，离子强度高，T Tmm高，范围变宽。高，范围变宽。高，范围变宽。高，范围变宽。G-CG-C对中含对中含对中含对中含
22、有有有有3 3个氢键，个氢键，个氢键，个氢键，较较较较A-TA-T对中对中对中对中仅有仅有仅有仅有2 2个氢个氢个氢个氢键更为稳键更为稳键更为稳键更为稳定定定定5.2.4核酸的测定核酸的测定l l1 1、紫外分光光度法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、紫外分光光度法l l2 2、定糖法：、定糖法：、定糖法：、定糖法：l lDNADNA、RNARNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基化合物，或水解得到化合物，或水解得到化合物，或水解得到化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖核糖和脱氧核
23、糖核糖和脱氧核糖核糖和脱氧核糖能与某些酚类、苯能与某些酚类、苯能与某些酚类、苯能与某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质（简便，定性胺类化合物结合成有色物质（简便，定性胺类化合物结合成有色物质（简便，定性胺类化合物结合成有色物质（简便，定性oror颜色深浅定量）颜色深浅定量）颜色深浅定量）颜色深浅定量）l lRNARNA浓盐酸苔黑酚（浓盐酸苔黑酚（浓盐酸苔黑酚（浓盐酸苔黑酚（3 3，5-5-二羟甲苯）共热二羟甲苯）共热二羟甲苯）共热二羟甲苯）共热绿色绿色绿色绿色l lDNADNA浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热蓝色蓝色蓝色蓝
24、色l l3 3、定磷法：、定磷法：、定磷法：、定磷法：DNADNA含磷量含磷量含磷量含磷量9.2%9.2%，RNARNA含磷量含磷量含磷量含磷量9 9l l1g1g磷相当于磷相当于磷相当于磷相当于11g11g核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂仅测得与嘌呤连接的糖仅测得与嘌呤连接的糖仅测得与嘌呤连接的糖仅测得与嘌呤连接的糖4、核酸分析时样品的预处理、核酸分析时样品的预处理l l用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物
25、材料中核酸或用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或其水解物含量时，需先经预处理其水解物含量时，需先经预处理其水解物含量时，需先经预处理其水解物含量时，需先经预处理去掉杂质，避免干扰去掉杂质，避免干扰去掉杂质，避免干扰去掉杂质，避免干扰l l1 1）将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆稀三氯乙酸稀三氯乙酸稀三氯乙酸稀三氯乙酸or1or1高氯酸低温抽提几次，得到高氯酸低温抽提几次，得到高氯酸低温抽提几次，得到高氯酸低温抽提几次，得到沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多沉淀为
26、蛋白质、核酸、脂类、多沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖糖糖糖等等等等l l2 2）用有机溶剂抽提用有机溶剂抽提用有机溶剂抽提用有机溶剂抽提去除脂溶性磷脂去除脂溶性磷脂去除脂溶性磷脂去除脂溶性磷脂等物质等物质等物质等物质不溶于不溶于不溶于不溶于酸的非酸的非酸的非酸的非脂化合物如脂化合物如脂化合物如脂化合物如DNADNA、RNARNA、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物l l再采用再采用再采用再采用酸酸酸酸（5 5三氯乙酸或三氯乙酸或三氯乙酸或三氯乙酸或6 6高氯酸，高氯酸，高氯酸，高氯酸，9090o oC C，15
27、min15min，再定，再定，再定，再定糖法测定）或糖法测定）或糖法测定）或糖法测定）或碱处理法碱处理法碱处理法碱处理法（3737o oC C，0.3-1mol/L0.3-1mol/LNaOHNaOH，18h18h，DNADNA，RNARNA能够分开）能够分开）能够分开）能够分开）5.3核酸的作用与用途核酸的作用与用途l l核酸作用：核酸作用：核酸作用：核酸作用：与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质密切关
28、系，又是蛋白质合成不可缺少的物质密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质诸多恶性诸多恶性诸多恶性诸多恶性肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关l l1 1、嘌呤和嘧啶类生化产品：、嘌呤和嘧啶类生化产品：、嘌呤和嘧啶类生化产品：、嘌呤和嘧啶类生化产品：核酸组成中的碱基嘌呤化合核酸组成中的碱基嘌呤化合核酸组成中的碱基嘌呤化合核酸组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻
29、断蛋白质、物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：5-5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶氟尿嘧啶氟尿嘧啶l l2 2、核苷类生化产品：、核苷类生化产品：、核苷类生化产品：、核苷类生化产品：如辅酶如辅酶如辅酶如辅酶A Al l3 3、核苷酸类生化产品：、核苷酸类生化产品：、核苷酸类生化产品：、核苷酸类生化产品：如免疫核糖核酸如免疫核糖核酸如免疫核糖核酸如免疫核糖核酸iRNAiRNA、转移因、转移因、转移因、转移因子子子子5.4动物脏器核酸的提取分离方法
30、动物脏器核酸的提取分离方法l l核酸及其衍生物类药物，核酸及其衍生物类药物，核酸及其衍生物类药物，核酸及其衍生物类药物，属天然大分子，结构复杂属天然大分子，结构复杂属天然大分子，结构复杂属天然大分子，结构复杂采采采采用生物材料为原料的用生物材料为原料的用生物材料为原料的用生物材料为原料的提取法提取法提取法提取法制造制造制造制造l l核苷酸类及其衍生物，核苷酸类及其衍生物，核苷酸类及其衍生物，核苷酸类及其衍生物，小分子，结构简单小分子，结构简单小分子，结构简单小分子，结构简单化学合成法化学合成法化学合成法化学合成法l l一、一、一、一、RNARNA的提取分离的提取分离的提取分离的提取分离l l动
31、物组织捣碎动物组织捣碎动物组织捣碎动物组织捣碎匀浆匀浆匀浆匀浆0.14mol/L NaCl 0.14mol/L NaCl 溶液提取溶液提取溶液提取溶液提取调调调调pHpH至至至至4.54.5，RNA.RNA.蛋白蛋白蛋白蛋白 ，RNARNA与蛋白质分开的方法：与蛋白质分开的方法：与蛋白质分开的方法：与蛋白质分开的方法：l l1 1）乙醇沉淀法）乙醇沉淀法）乙醇沉淀法）乙醇沉淀法l l2 2）盐酸胍和去污剂分离法）盐酸胍和去污剂分离法）盐酸胍和去污剂分离法）盐酸胍和去污剂分离法l l3 3）酚法）酚法）酚法）酚法二、二、DNA的提取分离的提取分离l l利用核糖核蛋白在利用核糖核蛋白在利用核糖核蛋
32、白在利用核糖核蛋白在0.14mol/L0.14mol/LNaClNaCl可溶可溶可溶可溶，而，而，而，而DNADNA核蛋核蛋核蛋核蛋白则可溶于水或高浓度的盐溶液（白则可溶于水或高浓度的盐溶液（白则可溶于水或高浓度的盐溶液（白则可溶于水或高浓度的盐溶液（ 1mol/L1mol/LNaClNaCl ）l l组织捣碎组织捣碎组织捣碎组织捣碎 0.14mol/L0.14mol/LNaClNaCl反复洗涤以去除反复洗涤以去除反复洗涤以去除反复洗涤以去除RNARNA（或（或（或（或0.1mol/L0.1mol/LNaClNaCl 0.05mol/L0.05mol/LNaClNaCl 枸橼酸钠）枸橼酸钠）枸
33、橼酸钠）枸橼酸钠）去污去污去污去污剂剂剂剂SDSSDS使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性使蛋白质变性沉淀用沉淀用沉淀用沉淀用1mol/L1mol/LNaClNaCl溶解溶解溶解溶解乙醇乙醇乙醇乙醇沉淀沉淀沉淀沉淀去污剂精制，反复多次去污剂精制，反复多次去污剂精制，反复多次去污剂精制，反复多次l l常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋白白白白离心；离心；离心；离心；SDSSDS；苯酚处理，离心分层；苯酚处理，离心分层；苯酚处理，离心分层；苯酚处理，
34、离心分层l l提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）5.5转移因子的制备转移因子的制备l lTransferfactorTransferfactor（TFTF）一种多核苷酸和多肽小分子物质，一种多核苷酸和多肽小分子物质，一种多核苷酸和多肽小分子物质，一种多核苷酸和多肽小分子物质，为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体为细胞免疫促进剂。可将
35、供体的细胞免疫性转移给受体正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。 临床用于免疫临床用于免疫临床用于免疫临床用于免疫缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性 。l l制备制备制备制备TFTF的原料的原
36、料的原料的原料除特异性供体白细胞外，一般采用正常人除特异性供体白细胞外，一般采用正常人除特异性供体白细胞外，一般采用正常人除特异性供体白细胞外，一般采用正常人血液、脾和扁桃体等原料血液、脾和扁桃体等原料血液、脾和扁桃体等原料血液、脾和扁桃体等原料l l提取工艺中提取工艺中提取工艺中提取工艺中主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和助滤剂再过滤等助滤剂再过滤等助滤剂再过滤等助滤剂再过滤等5.6辅酶辅酶A的提取的提取l l辅酶辅酶辅酶辅酶A A（CoenzymeACoenzymeA，Co
37、ACoA），是由等分子的泛酸、腺，是由等分子的泛酸、腺，是由等分子的泛酸、腺，是由等分子的泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，ADPADP的衍的衍的衍的衍生物或类似物，相对分子量为生物或类似物，相对分子量为生物或类似物，相对分子量为生物或类似物，相对分子量为767.54767.54l l主要起传递酰基的作用主要起传递酰基的作用主要起传递酰基的作用主要起传递酰基的作用，来回接受和放出酰基，携带酰，来回接受和放出酰基，携带酰，来回接受和放出酰基，携带酰，来回接受和放出
38、酰基，携带酰基的部位在基的部位在基的部位在基的部位在SHSH上上上上以以以以HSCoAHSCoA表示表示表示表示l l对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，l l作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等低热、脂肪肝
39、、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等疾病的重要辅助药物疾病的重要辅助药物疾病的重要辅助药物疾病的重要辅助药物5.6辅酶辅酶A的提取的提取l l分离过程：分离过程：分离过程：分离过程：预处理预处理预处理预处理提取提取提取提取除蛋白除蛋白除蛋白除蛋白CMACMA树脂纯化树脂纯化树脂纯化树脂纯化LD-601LD-601大孔吸附剂二次纯化大孔吸附剂二次纯化大孔吸附剂二次纯化大孔吸附剂二次纯化浓缩、沉淀、干燥浓缩、沉淀、干燥浓缩、沉淀、干燥浓缩、沉淀、干燥l l工艺过程中工艺过程中工艺过程中工艺过程中CoACoA的定性跟踪方法：的定性跟踪方法：的定性跟踪方
40、法：的定性跟踪方法：硝基盐巯基显色法硝基盐巯基显色法硝基盐巯基显色法硝基盐巯基显色法（CoACoA分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强烈红色）烈红色）烈红色）烈红色）l l定量检测方法：定量检测方法：定量检测方法：定量检测方法：磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（PTAPTA）紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法l l一般工艺制得的一般工艺制得的一般工艺
41、制得的一般工艺制得的CoACoA制剂，制剂，制剂，制剂，有氧化型和还原型两种成分有氧化型和还原型两种成分有氧化型和还原型两种成分有氧化型和还原型两种成分，磺胺乙酰化法测得的是制剂中磺胺乙酰化法测得的是制剂中磺胺乙酰化法测得的是制剂中磺胺乙酰化法测得的是制剂中CoACoA的总效价的总效价的总效价的总效价5.8从啤酒酵母中提取从啤酒酵母中提取RNAl l工业制取工业制取工业制取工业制取RNARNA主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、白地霉和青霉菌等白地霉和青霉菌等白地霉和青霉菌等白地霉和青霉
42、菌等l l以上菌株中的核酸大部分是以上菌株中的核酸大部分是以上菌株中的核酸大部分是以上菌株中的核酸大部分是RNARNA，而，而，而，而DNADNA的量很少，的量很少，的量很少，的量很少，只要将菌体分离后经只要将菌体分离后经只要将菌体分离后经只要将菌体分离后经RNARNA抽提后即可抽提后即可抽提后即可抽提后即可废弃酵母泥提废弃酵母泥提废弃酵母泥提废弃酵母泥提取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在高核问题）高核问题）高核问题）高核问题）l l常用工业方法
43、：常用工业方法：常用工业方法：常用工业方法：稀碱法、浓盐法和自溶法，氨法破壁稀碱法、浓盐法和自溶法，氨法破壁稀碱法、浓盐法和自溶法，氨法破壁稀碱法、浓盐法和自溶法，氨法破壁RNARNA从细胞中释放，在进行提取、沉淀和纯化从细胞中释放，在进行提取、沉淀和纯化从细胞中释放，在进行提取、沉淀和纯化从细胞中释放，在进行提取、沉淀和纯化啤酒酵母中啤酒酵母中RNA的提取工艺的提取工艺l l破胞（破胞（破胞（破胞（1 1倍体积的倍体积的倍体积的倍体积的1 1稀碱、稀碱、稀碱、稀碱、8 81010的浓盐或的浓盐或的浓盐或的浓盐或1 1的氨水）的氨水）的氨水）的氨水）离心分离得上清离心分离得上清离心分离得上清离
44、心分离得上清调等电点调等电点调等电点调等电点2 22.52.5离心分离取沉淀离心分离取沉淀离心分离取沉淀离心分离取沉淀脱水干燥脱水干燥脱水干燥脱水干燥l l基于被淘汰的基于被淘汰的基于被淘汰的基于被淘汰的啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量高而核酸含啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量高而核酸含啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量高而核酸含啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量高而核酸含量较低量较低量较低量较低常用得的一次沉淀技术难以获得高纯度的优质常用得的一次沉淀技术难以获得高纯度的优质常用得的一次沉淀技术难以获得高纯度的优质常用得的一次沉淀技术难以获得高纯度的优质核酸核酸核酸核酸先调先调先调先调蛋白质等电点（蛋白质等电点（蛋白质等电点（蛋白质等电点（pH4.2pH4.2）除杂蛋白，再调除杂蛋白，再调除杂蛋白，再调除杂蛋白，再调至至至至核酸等电点核酸等电点核酸等电点核酸等电点2 2左右左右左右左右l lRNARNA含量测定：含量测定：含量测定：含量测定：紫外分光光度法、定磷法紫外分光光度法、定磷法紫外分光光度法、定磷法紫外分光光度法、定磷法
