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1、1993年诺贝尔化学奖Kary mullis and Michael SmithPcr技术 彭梦露制作Press Release: The 1993 Nobel Prize in Chemistry13October1993TheRoyalSwedishAcademyofScienceshasdecidedtoawardthe1993NobelPrizeinChemistryforcontributions to the development of methods within DNA-based chemistry,withhalftoDrKary B. Mullis,LaJolla,Ca
2、lifornia,U.S.A.,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,andhalftoProfessorMichael Smith,UniversityofBritishColumbia,Vancouver,Canada,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein stud
3、ies.IntroductionPolymerase chain reaction (PCR) has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology and for good reason: it is a rapid, inexpensive and simple means of producing relatively large numbers of copies of DNA molecules from minute quantities of source DNA materi
4、al-even when the source DNA is of relatively poor quality. PCR involves preparation of the sample, the master mix and the primers, followed by detection and analysis of the reaction productsTheapplicationsofMullisPCRmethodarealreadymany.ItisforexamplepossibleusingsimpleequipmenttomultiplyagivenDNAse
5、gmentfromacomplicatedgeneticmaterialmillionsoftimesinafewhours,whichisofverygreatsignificanceforbiochemicalandgeneticresearch.Themethodoffersnewpossibilitiesparticularlyinmedicaldiagnostics,andisused,forexample,fordiscoveringHIVvirusorfaultygenesinhereditarydiseases.ResearcherscanalsoproduceDNAfroma
6、nimalsthatbecameextinctmillionsofyearsagobyusingthePCRmethodonfossilmaterial.原理简介： PCR 技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。何为Pcr技术？Pcr:Polymerase chain reaction就是反复进行包括热变性退火引物延伸三步骤的循环过程。1
7、.热变性：基因组DNA在95度下加热5分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。2.退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板引物复合物。3.引物延伸：迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。置反应混合物于70摄氏度，一分钟，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3端开始，沿着53的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。经上述变性-退火-引物延伸这一循环，双链DNA拷贝数增加一倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行2530个循环，拷贝数即扩增上百万倍。ThePCRmethodcanbeusedforr
8、eduplicatingasegmentofaDNAmolecule,e.g.fromabloodsample.Theprocedureisrepeated20-60times,whichcangivemillionsofDNAcopiesinafewhours.PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件-模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合
9、酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。后来，从耐热菌株Thermusaquaticus纯化出耐热的DNA聚合酶TaqDNAPolymerase,具有极好的热稳定性。 操作步骤1在冰浴中，按以下次序
10、将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10PCRbuffer5ldNTPmix（2mM）4l引物1（10pM）2l引物2（10pM）2lTaq酶（2U/l）1lDNA模板（50ng-1g/l）1l加ddH2O至50l视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 40s 58 30s 72 60s，循环30-35次，最后在72 保温7min。3结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100l氯仿进行抽提反应混合液，以除
11、去石蜡油；否则，直接取5-10l电泳检测。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成cDNA文库；(3)从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。toreallyworkinbiology,trainingisagoodthing.Itsadeepsubject,andinmanywaysquitedissimilartocomputerscienceorelectricalengineeringorsimilarfields.Ithasmanysurprises,andthewholewetlabexperimentalapproachishardtogetoutofbooks.谢谢！
