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1、第六章第六章核核酸酸1二十世纪是二十一世纪是物理学生命科学的世纪的世纪生命是生命=核酸+蛋白质二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪？2第一节第一节 核酸概论核酸概论一、核酸的发现和研究简史一、核酸的发现和研究简史34二、核酸的种类和分布二、核酸的种类和分布（一）脱氧核糖核酸（一）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)原核：裸露的DNA分子集中于核区真核：细胞核DNA：与组蛋白、非组蛋白形成染色体细胞器DNA：双链环形，一般裸露56（二）核糖核酸（二）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、转移RNA（transferRNA,tRNA):保守性最强2、核糖体RN
2、A（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesengerRNA,mRNA)4、特殊功能的RNASmallnuclearRNA,snRNASmallnucleoarRNA,snoRNASmallcytoplasmicRNA,scRNAAntisenseRNARibozymeRNaseP7三、核酸的功能（一）DNA是主要的遗传物质1944，O.Avery肺炎双球菌转化实验1952，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验8910111213（二）（二）RNA功能的多样性功能的多样性1、参与蛋白质的合成2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用14第
3、二节第二节核酸的结构核酸的结构15核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)戊糖(pentose)碱基(base)一、核酸的化学组成一、核酸的化学组成16P479表13-1两类核酸的基本化学组成RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基17（一）、（一）、碱基碱基P479结构式1.嘧啶碱：尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶2.嘌呤碱：腺嘌呤鸟嘌呤嘌呤衍生物：3.核酸中的修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物P479表13-2核酸中的稀有碱基18192021（二）、（二）、核苷与脱氧核苷核
4、苷与脱氧核苷1、基本核苷、基本核苷P480结构式腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷22嘧啶碱：C1N1，嘌呤碱：C1N9。核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型碱基平面与核糖平面互相垂直232、核酸中的稀有核苷、核酸中的稀有核苷稀有碱基稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（）P481甲基化核糖24（三）、（三）、核苷酸核苷酸核苷中戊糖C2、C3、C5羟基被磷酸酯化P481结构式：5-AMP3-dCMP251、构成构成DNA、RNA的核苷酸的核苷酸P481表表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP262、细胞内的游离核苷酸及其衍生物细胞内的游离核苷酸及其衍生物核苷5-多磷
5、酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸3,5-cAMP，3,5-cGMP信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpppppGppppApp核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。2728293031二、二、DNA的结构的结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。32（一）、（一）、DNA的一级结
6、构的一级结构蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸P482图13-1磷酸二酯酶对核酸的水解作用DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。P483图13-2DNA中多核苷酸的一个片段及缩写符号33写法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG334DNA一级结构的不均一性一级结构的不均一性（1）重复序列）重复序列正向重复正向重复(?repeat)反向重复（回文序列）反向重复（回文序列）(invertedrepeat,palindromesequence)较长的回文结构，可形成茎环结构(
7、发夹结构)或十字形结构较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。转录的终止作用与回文结构有关。镜象重复（镜象重复（mirrorrepeat)某些情况下可以三股螺旋某些情况下可以三股螺旋DNA3536373839高度重复序列（highrepetivesequence,sateliteDNA，SSR)2-10bp/copy105-106copies/genome多为串联重复排列（tandemrepeats)分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧中度重复序列（middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genome多为间隔重
8、复rDNAtDNAHistonegenecluster低拷贝重复：基因家族单拷贝序列（singlecopysequence)40（2）富含富含AT的序列的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。41（二）、（二）、DNA的二级结构的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNANa盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。42Chargaff规律规律1950年年a.所有生物的DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。P485表13-5。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基
9、组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。43DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。Franklin441、Watson-Crick双螺旋结构模型双螺旋结构模型(B-DNA)P486图13-5两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距
10、离0.34nm，双螺旋平均直径2nm，大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm45两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条3546磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。47碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持48每圈螺旋10.4nt，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm，大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm495051
11、522、稳定双螺旋结构的因素、稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。533、DNA二级结构的多型性二级结构的多型性P489表13-6A-、B-、Z-DNA的比较相对湿度92%：BDNA相对湿度75%：ADNA。54（1）BDNA：典型的：典型的Watson-Crick双螺旋双螺旋DNA右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.32nm（2）A-DNA右手双螺旋，外
12、形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。555657（4）三股螺旋三股螺旋DNAK.Hoogsteen1963通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(Py):oligo(Pu)oligo(Py/Pu)58第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤嘧啶或寡嘌呤59T=A:A,CG：C+T=A:TCG：GP489图13-10三股螺旋三股螺旋DNA中的中的Hoogsteen-bonding第三股与寡嘌呤之
13、间同向平行，并按第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对配对60当当DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链以形成三股螺旋（铰链DNA，hingedDNA,H-DNA)P490图13-11H-DNA的结构的结构61DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。626364(三）、三）、DNA的三级结构的三级结构DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象超螺旋是DNA三级结构的主要形式65
14、1、环状环状DNA的三种典型构象的三种典型构象P491图图13-12（1）、）、松弛环形松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、）、解链环形解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、）、正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋DNA66MOV:PBCA0267501supercoilingofDNA67682、三种环形三种环形DNA的拓扑学特性的拓扑学特性69连环数（连环数（linkingnumber,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（扭转数（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示超螺旋数（缠绕数超螺旋数（缠绕数,
15、writhingnumber,W）连环数（L）缠绕数（T）扭曲数W松驰环25250解链环23230超螺旋2325-2L=T+W70比连环差（比连环差（specificlinkingdifference,）表示DNA的超螺旋程度(Superhelixdensity)=（LL0）/L0=每一圈初级螺旋（10bp，360）出现超螺旋数L0是指松驰环形DNA的L值71一般天然DNA分子中=-0.05=5%负向超螺旋SV405226bpT=522W=-26(L=496)=-0.05E.coli4.2X106bpT=4.2X105W=4.2X105X-0.05=-2X104负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕
16、不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等723、拓扑异构酶拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值。拓扑异构酶酶I（解旋酶）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每次催化使L值增加1。拓扑异构酶酶II（促旋酶）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2。734、染色体的结构、染色体的结构（1）、整个病毒可以看成游离的染色体）、整个病毒可以看成游离的染色体组成：核酸、蛋白、脂类、糖类基因组：单链或双链的DNA（或RNA），多数环状形状：丝状、多面体状、P493图13-13一些噬菌体的结构74（2）、细菌染色体的结构）、细菌染色体的结构（拟核，（拟核，nu
17、cleoid)细菌基因组多数为双链环状DNA，与碱性蛋白、RNA结合，形成带有无数突环的刷状染色体P494图13-15细菌的拟核结构75（3）、真核生物染色体的结构）、真核生物染色体的结构染色质、染色体常染色质、异染色质永久性异染色质、功能性异染色质核小体（nucleosome):146bp,组蛋白：H2A、H2B、H3、H4P495图13-17真核生物染色体真核生物染色体DNA的组装层次的组装层次76MOV：MCB4.0threedimensionalpackingofnuclearchromosomes77三、三、 RNA的结构的结构78（一）、（一）、RNA的一级结构的一级结构P483A
18、MP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。P484图13-3RNA分子中的一段结构79组成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。80（二）、（二）、tRNA的结构的结构70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右有较多稀有碱基3末端为CCA-OH5末端大多为pG或pC二级结构是三叶草形倒L形的三级结构P496三叶草形的二级结构氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码环额外环TC环（假尿嘧啶环）497倒L形的三级结构8182tRNA的功能：转运氨基酸识别密码子参与翻译起始参与
19、DNA的反转录参与基因表达调控83（三）、（三）、mRNA的结构的结构原核：多顺反子（原核：多顺反子（polycistronicmRNA)真核：单顺反子，断裂基因（真核：单顺反子，断裂基因（splitedgene)841、真核真核mRNA的结构的结构P484 图图13-4真核真核mRNA的结构的结构855-帽子：帽子：m7G5-ppp5-Nm（Nm）p-O型：m7G5-ppp5-Np-I：m7G5-ppp5-Nmp-Np-II:m7G5-ppp5-Nmp-Nmp-Np-甲基鸟苷5，5-三磷酸86由甲基化酶催化可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促
20、进蛋白质合成起始复合物的形成。873-端有一段约端有一段约30-300核苷酸的核苷酸的polyA。 转录后由poly(A)聚合酶催化加尾PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。polyA与mRNA半寿期有关，PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。882、原核原核mRNA的结构（多顺反子）的结构（多顺反子）由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polyA。SD序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端
21、富含嘧啶碱基的序列互补。89（四）、（四）、rRNA的结构的结构细菌：16SrRNA、5SrRNA、23SrRNA组成30S转录单位真核：18SrRNA、5.8SrRNA，28SrRNA组成45S的转录单位，5SrRNA单独转录。小亚基大亚基转录单位原核1652330真核185（单独转录）285.85+4590大肠杆菌5SrRNA结构P498图13-2016S、5SrRNA的结构91rRNA的功能：的功能：组成核糖体催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上参与tRNA与mRNA的结合92第三节第三节 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质93一、核酸的水解一、核酸的水解自学自学94（一）酸
22、水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键脱嘌呤：pH1.6，37，对水透析pH2.8，100，1h脱嘧啶：98-100%甲酸，175，2h三氟乙酸，155，60min（DNA）或80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的碱基组成95（二）、（二）、碱水解碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.31mol/LKOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。DNA抗碱水解生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。96（三）、（三）、酶水解酶水解非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA
23、（RNA）得3-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶971、核酸酶的分类、核酸酶的分类底物专一性：底物专一性：核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase作用方式：作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式：磷酸二酯键的断裂方式：5-（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸982、RNAaseRNaseH作用于DNA-RNA中的RNA链牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最适pH：7.0-8.2产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNaseT1耐热、耐酸产物
24、：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高RNaseT2产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸993、DNase核酸酶核酸酶S1作用于单链DNA部分牛胰核糖核酸酶，牛胰核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸DNA限制性内切酶限制性内切酶1004、N-糖苷酶糖苷酶101二、二、核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质选学选学磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点44.5RNA等电点22.51021、碱基的解离、碱基的解离P5041032、核苷的解离、核苷的解离P5051043、核苷酸的解离、核苷酸的解离P506表表14-1某些碱基、核苷、核苷酸的解离常数某些碱基、核苷、核苷酸
25、的解离常数1054、核酸的滴定曲线、核酸的滴定曲线P507图14-1核苷酸的滴定曲线P507图14-2小牛胸腺DNA的滴定曲线106三、三、核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm1071、鉴定纯度鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算含量计算1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断、判断DNA是否变性是
26、否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）108四、四、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交109(一一)、变性变性P508图14-4DNA变性过程核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。110变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。111增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DNA的变性是爆发
27、式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。1121、熔解温度（熔解温度（Tm）：）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295之间1132、影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。114G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P509图5-19图14-5Tm值与GC含量的关系115介质中离子强度介质中
28、离子强度离子强度高，Tm高。P509图14-6116(二二)、复性复性变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。117复性机制：10-20bp成拉链热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。118P352图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。1191个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则50%复性时，Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒E
29、.coli4.2106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，则复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5108秒，5758天。根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数120(三三)分子杂交分子杂交1211、SouthernBlottingDNA样品酶切电泳碱变性转膜固定杂交洗涤放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜，尼龙膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。122123124
30、2、NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。125第四节第四节核酸研究技术核酸研究技术126一、一、核酸的分离纯化和定量核酸的分离纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。127（一）、（一）、DNA分离纯化分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取
31、，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀128（二）、（二）、RNA的制备的制备RNase的灭活：玻璃器皿：140-200，8塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂129用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：1.89g/
32、mlmRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法130（三）、核酸的定量（三）、核酸的定量P514紫外分光光度法紫外分光光度法定磷法定磷法定糖法定糖法131二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。132（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=
33、0+4.22（r2-r02）10-10：浮力密度：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离133（二）密度梯度超速离心测定（二）密度梯度超速离心测定DNA的的G-C含量含量G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。134（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象RNADNA变性DNA双链DNA蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大135（四）密度梯度超速离心纯化（四）密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象或不同构象的的DN
34、A超螺旋超螺旋DNADNA或或136三、三、核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳（一）、（一）、琼脂糖电泳琼脂糖电泳用于大片段用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广的分离，精度低，但分离范围广137影响迁移率的因素：核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比凝胶浓度DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/mlEBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛138139琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定分子量的测定琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化的制备与纯化140（二）、（二）、PAGE电泳电泳用于小片段用于小
35、片段DNA的分析，精度非常高的分析，精度非常高141四、限制性核酸内切酶与四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建物理图谱构建（1979年发现）年发现）(一一)、限制修饰系统限制修饰系统限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA142(二二)、II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。143II型酶的切割频率识别位点444=256646=4096848=65536限制酶的命名：E.coRI第一位：属名E（大写
36、）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号144同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。BamHI：GGATCCBstIGGATCCMboIGATCSau3AGATC同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。BclITGATCABglIIAGATCA145星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。例如HindIIIAAGCTT146(三三)、DNA物理图谱及构建物理图谱及
37、构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（2）双酶降解147五、五、DNA序列分析序列分析（一）（一）双脱氧终止法双脱氧终止法英国Sanger1955确定牛胰岛素结构，1958获诺贝尔化学奖1975设计出DNA测序法，1980获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。148149150151MOV:MCB4.0DideoxysequencingofDNA152DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP
38、153（二）（二）化学裂解法化学裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG154G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸/哌啶C反应：肼/NaCl/哌啶C+T：肼/哌啶哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂155硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A
39、*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P*ACTTCGACAG156（三）（三）RNA的侧序的侧序（1）酶裂解法）酶裂解法胰RNaseA：嘧啶结尾米曲霉RNaseT1：鸟苷酸结尾黑粉菌RNaseU2：腺苷酸结尾多头黏菌RNasePhyI：A、G、U结尾157（2）化学裂解法）化学裂解法（3）逆转录成）逆转录成cDNA法法158六、六、DNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR159模板模板DNA（单链）（单链）引物引物DNA聚合酶聚合酶（Taq）dNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYMERASECHAINREACTION160七、七、DNA的化学合成：的化学合成：P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：35端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护161162163
