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1、第四章 核酸与蛋白质的分离与纯化课程要求掌握 DNA、RNA及蛋白质的分离与纯化原理分离纯化的核酸与蛋白质的注意事项熟悉核酸与蛋白质分离与纯化技术的应用前景 了解本章课程内容1核酸分离与纯化的基本原理及技术路线DNA的分离与纯化2RNA的分离与纯化3蛋白质的分离与纯化4n核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。n蛋白质是生物功能的执行者，具有生物催化、物质运输、运动、防 御、调控等多种生理功能。n得到高度纯化同时具有生物活性的目的物质是研究核酸和蛋白质的 关键问题。从分子水平上认识生命的现象已经成为现代生物科学发展的主要方向，核酸和蛋白质作为体内最重要的生物大分子，是生命体结构和功能的重
2、要基础。 因此，核酸及蛋白质的分离纯化技术起到决定性作用。前言1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线l核酸分离与纯化的基本原则l核酸分离与纯化的技术路线 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3, 5磷酸二酯键连接成的一类生物大分子，包括核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两类。真核生物染色体DNA(细胞核,内双链线状)细胞器DNA(线粒体或叶绿体,双链环状)原核生物染色体DNA质粒DNA(双链环状)(双链环状)核酸简介核酸分离与纯化的基本原则保持核酸结构的完整性n控制缓冲液酸碱度：pH 410n注意机械剪切力n提取温度：04度n注意核酸酶1n蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质n对酶有抑制作用的有机溶
3、剂和高浓度的金属离子n其他核酸分子尽量排除其他分子的污染2核酸分离与纯化的技术路线主要技术路线核酸的释放核酸的分离与纯化核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸鉴定与保存机械法不适合真核基因组DNA，非机械法中溶胞法应用最广泛破碎细胞方法机械法固体前切作用珠磨法压榨液体剪切作用高压均浆超声破碎非机械法干燥法溶胞法酶溶法化学法物理法核酸分离与纯化的技术路线核酸分离纯化的第一步就是裂解细胞，释放核酸。 核酸的释放1n分离纯化步骤多，核酸纯度高但得率低；分离纯化步骤简化，得率高纯度低。复杂的混合物中纯化核酸时，清除的主要杂质包括三部分：核酸分离与纯化的技术路线核酸分离纯化的方法应结合核酸制备的用途加以合适设计。
4、核酸的分离与纯化2（1）核酸的浓缩固体聚乙二醇（PEG）浓缩将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。核酸分离与纯化的技术路线n核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法丁醇抽提浓缩正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。核酸的浓缩、沉淀与洗涤3n沉淀的特点1.易将核酸溶液调至所需浓度2.改变溶解核酸的缓冲液种类3.去除部分杂质与某些盐离子核酸分离与纯化的技术路线n沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。n可选择有机溶剂沉淀核酸加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用7075%的乙醇洗涤。
5、（2）核酸的沉淀与洗涤(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，33g/ml单链寡核苷酸）A260稀释倍数50 g/ml（1）紫外分光光度法测定DNA在A260nm的光吸收值n只用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液核酸分离与纯化的技术路线UVmini1240UV1700UV2450/2550岛津紫外可见分光光度计系列 如计算DNA浓度核酸的鉴定-浓度鉴定4原理：荧光染料溴化乙锭（EB），可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。核酸分离与纯化的技术路线特点：适用于低浓度核酸溶液的定量分析,高灵敏度：1-5 ng，但具有强致癌性（2）荧
6、光光度法荧光光度法（1）紫外分光光度法 A260 /A280 的比值来判定有无蛋白质污染和鉴定核酸纯度的重要指标。 纯的DNA A260与A280之比应在1.8 纯的RNA A260与A280之比应在2.0 （2）荧光光度法 用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果进行评定。核酸分离与纯化的技术路线核酸的鉴定-纯度鉴定4核酸凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪剂，结果可判定核酸制品的完整性。n；核酸分离与纯化的技术路线n总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。n基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象正常时，28SRNA
7、的荧光强度约为18SRNA的2倍，否则提示RNA的降解。核酸的鉴定-完整性鉴定4核酸分离与纯化的技术路线由于反复冻融产生的机械剪切力对核酸样品有断裂作用，在实际保存时，最好将核酸制品小量分装保存。核酸的保存5nTE缓冲液中-70保存数年nTE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。n在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染（1）DNA的保存n可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70保存n可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 保存。n以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。（2）RNA的保存2D
8、NA的分离与纯化l基因组DNA的分离与纯化l质粒DNA的分离与纯化lDNA片段的回收2DNA的分离与纯化l基因组DNA的分离与纯化l质粒DNA的分离与纯化lDNA片段的回收n真核生物染色体DNA潜在反应基团隐藏在螺旋内部，由于碱基对外侧受磷酸和戊糖的保护，并且内部碱基堆积力的作用进一步加强。真核生物DNA具有强化学耐受性n核内染色体DNA，惰性很强的分子基因组DNA的分离与纯化真核生物DNA的特性1大于150kb的DNA分子多数易被切断n高分子量的DNA在物理上易被破坏。n溶液中形态：长而弯曲的形态，易卷曲，黏滞。n易受到吸液、振荡、搅拌等引起的剪切作用而断裂n相对分子质量大的哺乳动物DNA,
9、 对机械剪切力敏感,提纯时难保证完整性n相对分子质量小的噬菌体DNA，采用常规方法不会造成其DNA 的断裂DNA易以片段形式被分离基因组DNA的分离与纯化基因组DNA的分离与纯化真核细胞基因组DNA分离纯化一般路线2基因组DNA的分离与纯化提取注意事项n尽量避免DNA断裂和降解n提取方法： 1、温和裂解细胞并溶解DNA，使DNA与组蛋白分离，并完整地以可溶形式分离出来。 2、采用酶学或化学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。基因组DNA的分离与纯化细胞的破碎3真核细胞基因组DNA分离纯化主要方法有：酚抽取法，甲酰胺解聚法，玻璃棒缠绕法，各种快速方法等。基因组DNA的分离与纯化不同哺乳动物基因组
10、DNA提取方法比较真核细胞基因组DNA分离纯化方法4视频n本法最初于1976年由Stafford及其同事创立基因组DNA的分离与纯化EDTA和SDS存在下，蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白PH8.0的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA乙醇或异丙醇进行沉淀123n改良方法获得DNA大小100-150kb（1）酚抽提法基因组DNA的分离与纯化基因组DNA的分离与纯化酚抽提法制备基因组DNA流程图基因组DNA的分离与纯化基因组DNA的分离与纯化二价金属离子螯合剂1. 抑制DNA酶活性2 降低细胞膜的稳定性生物阴离子去污剂1.降解细胞膜2乳化脂质及蛋白质3.降解DNA酶4.避免DNA消化广谱蛋白酶1.裂解细
11、胞2.水解蛋白质3.消化DNA酶1.使蛋白质变性2.抑制DNA酶活性抽提出DNA进入水相，减少在蛋白质层的滞留主要试剂的作用酚抽提法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10ug大到数百ug的DNA样品。基因组DNA的分离与纯化温和尽量减少酚-氯仿抽提次数混合时要温和尽量保证DNA完整性 两个原则 防止DNase对DNA的降解减少对DNA的机械破坏注意事项n方法：破碎细胞方法同酚抽提法，用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA结合，再透析获得DNA，分子量一般大于200kbn方法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液饶于玻棒，生成DNA约
12、80kb。n应用：适用于构建高容量载体的DNA文库和进行分子质量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳基因组DNA的分离与纯化n应用：适用于Southern印迹杂交和PCR反应。（2）甲酰胺解聚法（3）玻璃棒缠绕法n包括细菌、支原体、衣原体、立克次体、放线菌和蓝绿藻等,是最简单的细胞生物体。n病原微生物引起感染性疾病n感染性疾病诊断复杂基因组DNA的分离与纯化原核生物种类原核生物的简介1n分子较大（细菌DNA可达2109bp），易受机械剪切力破坏n细菌种类比病毒复杂n破壁比较困难原核生物DNA制备困难基因组DNA的分离与纯化原核细胞基因组DNA的分离与纯化2分离步骤基因组DNA的分离与纯化n盐析法：
13、在溶菌酶和SDS溶菌后直接加入固体NaCl或NaClO4 盐析，离心除去蛋白质。n有机溶剂处理：使蛋白变性，离心分层后，变性蛋白将在水相与有机相之间的界面析出，易除去。（2）去除蛋白质n核糖核酸酶nCsCl密度梯度离心或蔗糖密度梯度离心n异丙醇选择性沉淀DNA（3）去除RNA（1）破碎菌体n使用去垢剂SDS或溶菌酶处理，充分破碎细胞壁nEDTA抑制DNase的活性n蔗糖提高溶液的黏度，减缓细胞破裂速度避免DNA断裂基因组DNA的分离与纯化常用方法学及评价n得完整DNA,首先要纯化病毒粒子：1.SDS或酚处理或两者结合处理2.避免剧烈振荡及搅拌防止DNA切断，使用宽口吸管吸取DNA溶液基因组DN
14、A的分离与纯化病毒粒子的纯化n病毒核酸提取：SDS-酚法病毒基因组DNA的分离与纯化32DNA的分离与纯化l基因组DNA的分离与纯化l质粒DNA的分离与纯化lDNA片段的回收质粒DNA的简介 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制和稳定遗传的共价闭合环DNA分子。 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。 共价闭合环状共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂质粒DNA的简介1DNA的扩增（细菌培养）质粒DNA的释放（菌体的裂解）质粒DNA的分离与纯化 质粒DNA分离常用方法：煮沸裂解法
15、，碱裂解法，SDS裂解法质粒DNA的分离与纯化质粒DNA的分离与纯化质粒DNA提取基本大致过程质粒DNA的分离2质粒DNA的分离与纯化n原理：在NaOH提供的强碱性（pH12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞膜使细胞裂解，释放出细胞内DNA及蛋白质。n简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。质粒DNA的分离与纯化碱裂解法流程图（1）碱裂解法质粒DNA的分离与纯化原理n利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。应用n该法剧烈，只用于提取相对分子质量小(15kb)的质粒DNA， 1.适用于大多数E.coli菌株, 2.不适宜会释放
16、出大量糖类的菌株及表达核酸内切酶EndA的菌株。质粒DNA的分离与纯化（2）煮沸裂解法n加热：使蛋白质和染色体DNA变性 降温：质粒DNA复性，染色体DNA不能复性质粒DNA的分离与纯化质粒DNA的分离与纯化SDS裂解法流程图(以动物组织为例）n裂解较温和,常用的抽提方法n将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中 以溶菌酶和EDTA裂解，酚-氯仿抽提n适合相对分子质量大(15kb)的质粒 DNA的抽提，但产率不高（3）SDS裂解法质粒DNA的分离与纯化质粒DNA纯化CsCl-EB法聚乙二醇沉淀法柱层析法质粒DNA的分离与纯化纯化质粒DNA的常用方法质粒DNA的纯化3质粒DNA的分离与纯化氯化铯-溴化乙锭密
17、度梯度平衡离心法（CsCl-EB法）特点n容量大、分辨率高、纯化效果好，纯化的首选方法。费时，设备与试剂昂贵。原理n细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭（EB）n1.蛋白质的密度最小位于最上层 2.RNA密度最大沉于管底 3.DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。开环或线性DNA油蛋白质闭环DNARNA沉淀质粒DNA的分离与纯化质粒DNA的分离与纯化聚乙二醇沉淀法n聚乙二醇沉淀：是一种分级沉淀n简单、经济、适用广，适用于分子克隆中所有常规的酶学反应及哺乳动物细胞的转染。质粒DNA的分离与纯化特点沉淀原理示意图质粒DNA的分离与纯
18、化柱层析法n纯化关键是用于填充层析柱的树脂。n树脂分类：疏水的相互作用 离子交换与吸附的相互作用n原理质粒DNA的分离与纯化柱层析法纯化细菌质粒DNA1.高盐下，DNA与硅基质可逆性的结合进行纯化。2.高盐造成磷酸二酯骨架脱水，暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖类物质，再加入TE或水，离心洗脱。质粒DNA的分离与纯化质粒DNA的分离与纯化纯化常用方法比较2DNA的分离与纯化l基因组DNA的分离与纯化l质粒DNA的分离与纯化lDNA片段的回收主要是从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离回收DNA片段。DNA片段的回收切胶回收DNA检测DNA琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电
19、泳待回收DNA样品DNA回收基本流程DNA片段回收的原则与要求1DNA片段的回收DNA片段的回收DNA片段回收的原则1.提高回收量2.清除杂质提高DNA样品的上样量，减少回收体积。常用方法为有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法DNA片段的回收DNA片段的回收从琼脂糖凝胶中回收DNA片段2n每种回收方法有其适用范围，应根据不同要求精选不同方法。DNA片段的回收n聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的标准方法是碾碎浸泡法。DNA片段的回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段33RNA的分离与纯化lRNA制备条件与环境l总RNA的分离与纯化lmRNA的分离与纯化3RNA的分离与纯化lRNA制备条件与环境l总RNA
20、的分离与纯化lmRNA的分离与纯化RNA制备条件与环境排除RNase的污染且抑制其活性是纯化成功与否的关键。1.避免细胞外RNase的污染并抑制其活性2.抑制细胞内RNase的活性并去除RNase。一般原则环境一般原则与环境1n实验室保持洁净n戴手套和口罩n玻璃器皿200干烤2hnDEPC水处理n冰浴n试剂，严格洗涤、消毒处理n选用一次性材料及新包装的化学试剂3RNA的分离与纯化lRNA制备条件与环境l总RNA的分离与纯化lmRNA的分离与纯化总RNA的分离与纯化总RNA的分离与纯化的方法2分离与纯化过程中使用的试剂与其用途1总RNA提取法中最常使用的方法。2.以异丙醇沉淀RNA，可选择性地沉
21、淀大分子rRNA和mRNA，故提取的总RNA中rRNA和mRNA比例高，小分子量RNA较少总RNA的分离与纯化一步法视频特点 ：简便、经济和高效，RNA提取质量高，且高完整性与纯度。总RNA的分离与纯化经典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。（1）异硫氰酸胍-酚氯仿一步法以（异）硫氰酸胍-酚为裂解液，再加入氯仿形成两相，变性的DNA与蛋白质位于两相之间，上层RNA溶液，最后异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤。总RNA的分离与纯化（2）商品化的单相裂解试剂法改良方法（3）其它方法n(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法n盐酸胍-有机溶剂法nLiCl-尿素法n热酚法3RNA的
22、分离与纯化lRNA制备条件与环境l总RNA的分离与纯化lmRNA的分离与纯化Poly(A+)：绝大多数mRNA在其3末端带有一个长短不一的poly(A)尾巴起始材料：总RNA样品mRNA的分离与纯化mRNA的分离与纯化基本原理1方法：oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析利用核酸的碱基配对原理，同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体mRNA的分离与纯化mRNA制备的一个标准方法。1.oligo(dT)-纤维素柱层析法mRNA的分离与纯化方法2mRNA的分离与纯化1.分离速度慢，柱易堵塞2.不适合同时对多个标本的处理3.难回收全部的poly(A+) RNA4.不适少
23、量RNA样品的分离纯化 哺乳动物细胞制备大量mRNA首选方法缺点可达总RNA的1%10%提取数量必须防止RNase的污染：总RNA溶液65中温育再冷却至室温后上样，oligo(dT)-纤维素柱可在4储存并反复使用注意事项mRNA的分离与纯化2.oligo(dT)-纤维素柱离心法适用情况n制备的mRNA可用于Northern杂交、RT-PCR及体外翻译。优点n克服了oligo(dT)-纤维素层析柱法流速慢、易堵塞等不足 通过一系列可离心的分离层析柱，达到快速制备的目的。n多个样品的批量处理，具有快速、产量高及质量好等优点原理：不用填柱mRNA的分离与纯化3.oligo(dT)-纤维素液相结合离心
24、法优点：可同时批量处理多个样品，能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA离心,收集70%的乙醇洗脱,沉淀原理利用oligo(dT)与poly(A)的互补配对特性、生物素与链亲和素的特异性结合和磁性分离。mRNA的分离与纯化4.磁性球珠分离法磁性球珠分离法mRNA原理特点产量提高,回收率高70%100%,纯度高，缺点细胞和组织的处理量不超过1g，磁珠价格贵适用情况能用于几乎所有的分子生物学实验mRNA的分离与纯化5.其他方法poly（U）-滤纸法在共价交联有poly（U）的滤纸上点样总RNA,再经洗涤后加热洗脱poly(U)-凝胶层析法Poly（U）-凝胶层析法利用poly（U）与po
25、ly(A)的互补配对原理。4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分离l蛋白质纯化后处理4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分离l蛋白质纯化后处理蛋白质分离与纯化的基本原则不同蛋白质的理化性质由氨基酸残基的种类、数目和序列决定。性 质 分离方法分子的大小与形状 超滤、透析、密度梯度离心、凝胶过滤层析、凝胶电泳在不同溶剂中的溶解度沉淀法、相分配法、分配层析法、结晶、溶剂抽提、逆流分配电荷分布性质 电泳技术、等电点沉淀、离子交换层析、聚焦层析、等电聚焦电泳生物功能专一性 亲和
26、层析（DNA亲和层析、免疫亲和层析、外源凝集素亲和层析等）疏水性疏水作用层析、反相HPLC蛋白质分离纯化主要的技术和方法如下表所示：蛋白质特性是分离纯化的依据1蛋白质分离与纯化的基本原则1. 材料的选择与破碎2. 建立蛋白质的活性测定方法3. 分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则4. 分离纯化条件设计原则蛋白质分离与纯化的基本原则蛋白质分离与纯化基本流程4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分离l蛋白质纯化后处理富含所要纯化的蛋白质并易于处理的材料。1.不同生物材料选用不同破碎方法：2.常用的破碎方法有机械法，物理法 化学法，裂解
27、法，酶解法等。原材料的准备及处理原材料选择原则预处理-破碎组织或细胞原材料的选择及预处理2超声破碎法渗透压法冻融法高速组织捣碎法人工研磨法高压挤压法玻璃匀浆器匀浆法原材料的准备及处理溶剂处理法去污剂处理法自溶法酶解法1.机械法2.物理法3.化学法4.酶解法4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分离l蛋白质纯化后处理目的：将目标蛋白质与细胞中其他物质分离，由固相转入液相，或从细胞内的生理状态转入到外界特定的溶液中。蛋白质的粗制分离定义：将经过预处理或破碎的细胞置于特定溶剂，使待纯化的蛋白质充分释放到溶剂中，并尽量保持其原来的天然状态，
28、不丢失生物活性的过程。方法：根据蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液及有机溶剂作为依据。蛋白质的粗制分离方法3（1）水溶液提取分离法蛋白质的粗制分离温度：在一定温度范围内(040之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离，常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵 等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集和沉淀，它的溶解度达到最低 。n和脂质结合牢固/分子中非极性侧链较多的蛋白质n由于亲水性和较强的亲脂性,可用有机溶剂如乙醇、丙酮、丁醇等蛋白质的粗制分离（2）
29、有机溶剂提取法4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分离l蛋白质纯化后处理 通过蛋白质粗制分离，体积较大的杂质大部分已被除去，在此基础之上，进一步对含有的目标蛋白质样品进行纯化。蛋白质的精制纯化常用方法：柱层析法、梯度离心法、电泳法n最常用方法为柱层析法，后几种方法常用作最后的精制纯化过程特点：简便、处理量大，提高分辨率、浓缩蛋白质溶液 但分离规模较小蛋白质的精制纯化方法4了解需要纯化的蛋白质的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质，而选择合适的层析方法、层析介质、加样、洗涤与洗脱条件,一般层析技术选择如下：蛋白质的精制纯化层析技
30、术的选择凝胶过滤法离子交换层析法或亲和层析法最后的精制纯化阶段第一次层析阶段分辨率高，纯化效果好，脱盐专一性强，纯化倍数高视频蛋白质的精制纯化（1）亲和层析亲和层析的基本过程特点：特异性好，选择性高，但具有局限性原理利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的分离方法。 应用生物特异性亲和层析：免疫亲和层析,凝集素亲和层析人工配体亲和层析蛋白质的精制纯化依据蛋白质具有等电点溶液pH值=等电点，蛋静电荷为=0，溶液ph值等电点，蛋白质带负电荷，溶液ph值等电点，蛋白质带正电荷（2）离子交换层析离子交换层析分离原理示意图影响因素PH值，交换基团类型，盐浓度，上样量，柱的塔板数，
31、洗脱梯度和流速常用离子交换剂纤维素离子交换剂，交联聚糖离子交换剂，琼脂糖离子交换剂蛋白质的精制纯化电泳法的选择原理在电场作用下,带电颗粒向着与其电性相反的电极方向移动的现象。常用电泳类型包括区带电泳，等电聚焦电泳及双向凝胶电泳蛋白质的精制纯化（1）等电聚焦原理利用具有不同等电点（pI）的蛋白质在线性pH梯度下泳动（蛋白质所处的pHpI时，向着负极移动，反之则向正极移动），并聚焦于与其pI值相同的pH位置，达到蛋白质混合物分离的方法。常用电泳胶固相pH梯度干胶条（IPG）应用常联用其他电泳，如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)及毛细管电泳蛋白质的精制纯化（2）十二烷基硫酸钠-
32、聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS的作用断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构SDS和还原剂(巯基乙醇,二硫苏糖醇DTT)的作用n分子被解聚或组成它们的多肽键n氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。n蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质的精制纯化（3）双向凝胶电泳(2-DE)n目前最有效 , 分辨率最高的蛋白质电泳手段n双向凝胶电泳=等电聚焦电泳+SDS-PAGE电泳 双向凝胶电泳示意图4蛋白质的分离与纯化l蛋白质分离与纯化的基本原则l原材料的准备与处理l蛋白质的精制纯化l蛋白质的粗制分
33、离l蛋白质纯化后处理n指除去纯化手段提纯的蛋白质溶液中常常含有的多余的盐离子浓 度的过程。n脱盐的主要方法有三种，即透析法、超滤法、凝胶过滤法。蛋白质的纯化后处理1.脱盐5脱盐、浓缩、干燥和保存蛋白质的纯化后处理n低浓度溶液通过去除溶剂变为高浓度溶液的过程.n常用的浓缩方法2.浓缩超滤法减压浓缩法：真空度，液体沸点有关吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝胶等沉淀法：硫酸铵沉淀法，聚乙二醇沉淀，免疫沉淀法，有机溶剂沉淀n真空干燥 ：其原理与减压浓缩相同，真空度愈高，溶液沸点愈低，蒸发愈快。通常适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存。 蛋白质的纯化后处理3.干燥蛋白质通过制备得到所需的产品后，为
34、了防止变质、保持生物活性、易于保存和运输，常常需要干燥处理n冷冻真空干燥：在真空干燥原理的基础之上增加温度因素。适用于各类蛋白质的干燥保存。常用的干燥方法蛋白质的纯化后处理4.样品的保存保存方法与蛋白质稳定性及保持生物活性有很大关系常用的保存方法n干粉保存：干燥的蛋白质制品一般比较稳定，贮藏方法简单，只需将干燥后的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，在04冰箱中保存即可。n液态保存：只在特殊情况下采用，并有严格的防腐保护措施（如防腐剂、稳定剂），保存时间不宜过长。大多数生物活性物质液态保存时，在04冰箱中保存即可。从近年核酸和蛋白质前沿研究的发展方向来看，组织、细胞的分离纯化所得的目的物质，
35、有助于从分子水平了解生命活动的规律及揭示生命现象的本质。高纯度的目的物质应用于工业生产、医疗保健、基因因工程等方面，如食品、发酵等的高活性酶制剂、猪胰岛素治疗糖尿病，转基因动、植物等。小结以精制分离纯化蛋白质和核酸为核心技术对指导工、农，医等方面的发展具有重大意义。思考题1.试讲述基因组DNA与质粒DNA分离与纯化的异同点。2.制备RNA的过程中应该注意哪些问题？3.常用蛋白质精制纯化的方法有哪些？请举例说明其应用。问题思考题1.试讲述基因组DNA与质粒DNA分离与纯化的异同点。基因组DNA质粒DNA 相同 提取步骤：细胞裂解-DNA释放-沉淀溶解差异对象分子量大分子量小，环状方法1.真核基因
36、组DNA：酚抽提法,甲酰胺解聚法等2.原核基因组DNA：溶酶法,CTAB法,超声破碎提取法等碱裂解法，SDS裂解法煮沸裂解法等原理1.碱性条件下，染色体DNA双螺旋结构解开而变性，难以复性。2.离心时，染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来1碱性条件下，质粒DNA的氢键断裂但两条互补链彼此缠绕,恢复中性时，很快复性，2离心时，质粒DNA则留在上清液思考题2.制备RNA的过程中应该注意哪些问题？获得完整的RNA分子的关键是排除Rnase的污染并抑制其活性，因此在制备过程中应注意：1.实验室保持洁净2.超净台保证规范操作2.戴手套和口罩3.玻璃器皿200干烤2h4.DEPC水处理5.冰浴6.试剂要严
37、格洗涤、消毒处理7.尽量选用一次性材料及新包装的化学等思考题3.常用蛋白质精制纯化的方法有哪些？请举例说明其应用。层析法电泳法亲和层析精制纯化的方法应用举例 层析法（亲和层析，离子交换层析）1.亲和层析:使用曼陀罗凝集素提纯多巴胺受体2.离子交换层析:BioRex70层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物 电泳法（等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，双向凝胶电泳)1.等电聚焦:种子的纯度鉴定2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质免疫印迹技术诊断囊虫病3.双向凝胶电泳：区分致病微生物临床隔离群区梯度离心法分离白细胞亚群，胎儿血红蛋白等（2）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法谢谢观看！
