《凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测学习教案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凋亡相关基因Bax在不同细胞中表达产物差异检测学习教案（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、会计学1凋亡凋亡(dio wn)相关基因相关基因Bax在不同细胞在不同细胞中表达产物差异检测中表达产物差异检测第一页，共17页。 原原理理 免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体(kngt)(kngt)间的免疫反应引入细胞标本，并通过对间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体抗原或抗体(kngt)(kngt)作定性、定位以及定量检测。作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质合力的物质( (生物素生
2、物素) )，应用于免疫组化，使得抗，应用于免疫组化，使得抗原抗体原抗体(kngt)(kngt)的亲和力比免疫组化高出的亲和力比免疫组化高出100100万倍。万倍。其更具高灵敏性和高特异性。其更具高灵敏性和高特异性。第1页/共16页第二页，共17页。原原理理BaxBax凋亡相关基因凋亡相关基因凋亡相关基因凋亡相关基因(jyn)(jyn)Bcl-2Bcl-2家族成员家族成员家族成员家族成员细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化）作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放作用线粒体膜，使其膜通透
3、性增加，释放作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放CytcCytc，细胞凋亡，细胞凋亡，细胞凋亡，细胞凋亡 第2页/共16页第三页，共17页。原原理理 本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色(xin s)剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色(xin s)（褐色）。第3页/共16页第四页，共17页。器材器材(qci)(qci)与试剂与试剂 仪器(yq)：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS
4、、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、H2O2-PBS、第4页/共16页第五页，共17页。 试试 剂剂 说说 明明n n PBS： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 ）n n 封闭液： 山羊血清(xuqng)(或BSA)，用时PBS稀释n n 一 抗： 小鼠IgG，用时PBS稀释n n 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠IgGn n H2O2-PBS（甲醇）n n 消除内源性过氧化物酶活性作用n n SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素n n 生物素过氧化物酶复合物) ：n n 抗生物素，起到放大作用n n DAB(diaminob
5、enzidine)显色液：n n 3,3-二氨基联苯胺第5页/共16页第六页，共17页。 实验实验(shyn)步骤步骤n n培养细胞（培养细胞（9696孔板，每组孔板，每组3 3正常、正常、3 3损伤、损伤、3 3损伤恢复）损伤恢复）n nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次(轻轻地洗涤轻轻地洗涤) )n n甲醇甲醇(jichn)(jichn)固定固定10min10minn nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次n n加入封闭液（加入封闭液（1:101:10）25l25l，3737，30min30minn n加一抗（加一抗（1:3001:300）25l25l，3737，
6、1h(1h(或或44过夜过夜) )n nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次n n加二抗（加二抗（1mlPBS1mlPBS加入生物素化山羊抗小鼠加入生物素化山羊抗小鼠IgG10lIgG10l）25l25l，3737，1h1hn nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次第6页/共16页第七页，共17页。 实验(shyn)步骤n n加加H2O2-PBSH2O2-PBS（甲醇），（甲醇），3737，30min30minn nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次n nSABCSABC工作液（工作液（1mlPBS1mlPBS加入加入SABC10lSABC10l，混匀），
7、混匀）20-30l20-30l，3737，1h1hn nPBSPBS洗，洗，5minX35minX3次次n nDABDAB显色：显色：n nDABDAB显色工作液配制（现配）：显色工作液配制（现配）：1ml1ml蒸馏水，加试剂蒸馏水，加试剂盒中盒中A A、B B、C C试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止控制，以蒸馏水终止(zhngzh)(zhngzh)反应。反应。n n观察结果观察结果第7页/共16页第八页，共17页。实验实验(shyn)(shyn)结果结果缺糖前 Hela 细胞(xbo)第8页/共16页第九页，共17页。 缺糖 24h
8、Hela细胞(xbo)第9页/共16页第十页，共17页。缺糖 48h Hela 细胞(xbo)第10页/共16页第十一页，共17页。缺糖前 PC 12细胞(xbo)第11页/共16页第十二页，共17页。缺糖 24 h PC 12细胞(xbo)第12页/共16页第十三页，共17页。缺糖 48 h PC 12细胞(xbo)第13页/共16页第十四页，共17页。注意事项注意事项n n一、二抗的稀释度、孵育时间和温度一、二抗的稀释度、孵育时间和温度(wnd)(wnd)与染与染色强度、背景有直接关系。色强度、背景有直接关系。n n染色背景过高，在染色背景过高，在DABDAB显色之前，用含显色之前，用含T
9、WEEN20TWEEN20的的PBSPBS洗涤标本洗涤标本4 4次，再次，再PBSPBS洗洗2 2次，然后次，然后DABDAB显色。显色。 DABDAB有毒性（小心）有毒性（小心）n nSABCSABC试剂盒保存在试剂盒保存在44为佳为佳(2(2年年) )，而，而-20-20短期短期内生物活性则被破坏内生物活性则被破坏 。n n购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳购试剂盒时注意厂家批号，其差异很大，会影响稳定性。定性。第14页/共16页第十五页，共17页。告告 知知实验（四）细胞(xbo)内微核的检测家系分析第15页/共16页第十六页，共17页。内容(nirng)总结会计学。Bax。第3页/共16页。生物素过氧化物酶复合物) ：。3,3-二氨基联苯胺。PBS洗，5min X 3次。缺糖前 PC 12细胞(xbo)。SABC试剂盒保存在4 为佳(2年)，而-20 短期内生物活性则被破坏。家系分析。第15页/共16页第十七页，共17页。
