教学课件第十一章基因工程

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1、第十一章 基因工程本章重点 基因工程的概念和一般操作流程。基因工程的概念和一般操作流程。 基因工程工具酶、载体、目的基因获得方基因工程工具酶、载体、目的基因获得方法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛选等。选等。 动物克隆技术与转基因技术动物克隆技术与转基因技术11.111.1基因工程概述基因工程概述 基因工程基因工程（genetic engineering），），也叫基也叫基因操作、遗传工程，或重组体因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中

2、，并使之无性繁殖（称一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为之为“克隆克隆”）和行使正常功能（称之为）和行使正常功能（称之为“表表达达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。学技术。 基因工程概述基因工程概述基因工程的基本流程基因工程的基本流程目的基因获得目的基因获得重组重组DNA分子构建分子构建导入受体细胞导入受体细胞转化体细胞扩增、鉴定与筛选转化体细胞扩增、鉴定与筛选11.2 11.2 工具酶工具酶11.2.111.2.1限制性内切酶限制性内切酶 识别双链识别双链DNA中特定序列并切割双链中特定序列并切割双链DNA的的核酸内切酶。核酸内切酶。

3、型和型和型限制酶的切点不固定，不能产生型限制酶的切点不固定，不能产生可以利用的可以利用的DNA片段，只有片段，只有型限制酶具有可型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的产生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的片段，因此基因工程中所用的限制酶都是限制酶都是型限制酶型限制酶。 限制性内切酶1IIII限制性内切酶基本特征限制性内切酶基本特征特异性位点切割双链特异性位点切割双链DNA识别序列为识别序列为4-6个碱基，大多双重交替对称个碱基，大多双重交替对称 切割产生平头末端切割产生平头末端(blunt end/flush end)和粘性

4、末端和粘性末端(cohesive)限制性内切酶2 EcoR l识别识别6个核苷酸序列，在特定的个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割之间切割DNA分子：分子： 限制性内切酶3 BamH识别识别6个核苷酸的序列，在特定的个核苷酸的序列，在特定的A-A之间切割之间切割DNA分子分子 限制性内切酶4 有少数限制的酶在双链有少数限制的酶在双链DNA的对称轴处切的对称轴处切割，产生平齐末端（平端），如割，产生平齐末端（平端），如Bal和和Sma 限制性内切酶用途 产生特异的限制酶片段；产生特异的限制酶片段； 建立建立DNA分子的限制酶图谱；分子的限制酶图谱； 构建基因文库构建基因文库 用限制酶切出的相同的

5、粘性末端，以便重组用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重组 11.2.2. DNA聚合酶 DNADNA聚合酶种类聚合酶种类大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶（全酶）（全酶） 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶大片段（大片段（Klenow片段）片段） T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 T7噬菌体聚合酶及经修饰的噬菌体聚合酶及经修饰的 T7噬菌体聚合噬菌体聚合酶（测序酶）酶（测序酶） 末端转移酶末端转移酶 逆转录酶逆转录酶 耐热耐热 DNA聚合酶（聚合酶（TaqDNA聚合酶）聚合酶） DNA聚合酶种类DNA聚合酶用途大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶（全酶）（全酶） 用切口平移方法标记用切口平移方法标记

6、DNA（可作杂交探针）可作杂交探针） 利用其利用其5-3外切核酸酶活性降解寡核着酸作外切核酸酶活性降解寡核着酸作为合成为合成cDNA第二链的引物第二链的引物 用于对用于对DNA分子的分子的3突出尾进行末端标记，突出尾进行末端标记，用于用于DNA序列分析序列分析 用途KlenowKlenow片段片段 补平限制性内切酶切割补平限制性内切酶切割DNA产生的产生的3凹端；凹端； 用用32P补平补平3凹端，对凹端，对DNA片段进行末端标记；片段进行末端标记； 对带对带3突出端的突出端的DNA进行末端标记；进行末端标记； 在在cDNA克隆中，用于合成克隆中，用于合成cDNA第二链；第二链； 在体外诱变中，

7、用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA； 应用双脱氧链末端终止法进行应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序测序 用途T4T4噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶 补平或标记限制性内切酶消化补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的后产生的3凹端凹端 对带有对带有3突出端的突出端的DNA分子进行末端标记分子进行末端标记 标记用作探针的标记用作探针的DNA片段片段 将双链将双链DNA的末端转化成为平端的末端转化成为平端 使结合于单链使结合于单链DNA模板上的诱变寡核着酸引物模板上的诱变寡核着酸引物得到延伸得到延伸 用途T7T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶及由此改造的测序酶聚

8、合酶及由此改造的测序酶 用于拷贝长段模板的引物延伸反应用于拷贝长段模板的引物延伸反应 通过补平或交换（置换）反应进行快速末端通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记标记 耐热耐热 DNADNA聚合酶（聚合酶（Taq DNATaq DNA聚合酶）聚合酶） 用于用于DNA测序测序 用于聚合酶链式反应（用于聚合酶链式反应（PCR）对对DNA片段进片段进行体外扩增行体外扩增 用途末端转移酶末端转移酶 给载体或给载体或CDNA加上互补的同聚尾加上互补的同聚尾 用于用于DNA片段片段3末端的放射同位素标记末端的放射同位素标记 用途11.2.3 DNA连接酶 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 连接带匹

9、配粘端的连接带匹配粘端的DNA分子分子 双链双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接分子互相连接或合成的接头相连接 11.2.4 核酸酶 S1S1核酸酶核酸酶 去除去除DNA片段的单链突出端，使之成为平端片段的单链突出端，使之成为平端 去除去除c cDNA合成时形成的发夹结构合成时形成的发夹结构 施行施行Sl核酸酶保护试验（核酸酶保护试验（Sl protectionSl protection或或Sl Sl mappingmapping），），分析转录产物分析转录产物 成熟成熟mRNA与基因组与基因组DNA杂交后，结合杂交后，结合Sl核核酸酶水解，可确定内含子在基因组酸酶水解，可确定内含子在基因

10、组DNA中的定中的定位位 修整渐进性删除突变的末端修整渐进性删除突变的末端 核酸酶Bal 31Bal 31核酸酶核酸酶 用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结构、机能分析构、机能分析 绘制绘制DNA限性内切图谱限性内切图谱 研究超螺旋研究超螺旋DNA的二级结构和致畸剂引起的的二级结构和致畸剂引起的双链双链DNA螺旋结构变化螺旋结构变化 11.3 11.3 基因工程载体基因工程载体 载体载体（vector）是把外源基因引入受体细胞是把外源基因引入受体细胞并在其中能自我复制的小并在其中能自我复制的小DNA 分子。分子。 基因工程中的载体应具有如下一些特性基因工

11、程中的载体应具有如下一些特性： 独立和稳定的独立和稳定的 DNA自我复制自我复制 易于从宿主细胞中分离，并进行纯化易于从宿主细胞中分离，并进行纯化 具有适当的限制性内切酶位点具有适当的限制性内切酶位点 有报告基因有报告基因 11.3.1 细菌质粒载体 质粒质粒是细菌染色体外的小型环状双链的是细菌染色体外的小型环状双链的DNA分子。分子。 质粒质粒DNADNA的分子特性的分子特性 质粒质粒DNA分子呈双链共价封闭环状、自然分子呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（旋转成超螺旋构型（closed circle DNA， ccDNA），），有时会因单链断裂而成为开链环状有时会因单链断裂而成为开链

12、环状DNA（open circle DNA， ocDNA）有时双链断有时双链断开成线性开成线性DNA（liner DNA， lDNA） 11.3.2 噬菌体载体 细菌质粒载体所能携带的外源基因只限于细菌质粒载体所能携带的外源基因只限于10kb以下的以下的DNA片段，噬菌体作为载体，可插片段，噬菌体作为载体，可插入长入长1010kbkb20kb20kb甚至更大的一些外源甚至更大的一些外源DNADNA片段。片段。 噬菌体噬菌体 噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大肠杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两类生主菌大肠杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两类生长方式。长方式。 1

13、1.3.3 粘性质粒载体 粘性质粒载体粘性质粒载体（也称柯斯质粒载体或粘粒，（也称柯斯质粒载体或粘粒，cosmid vector）本质上是含有抗性基因、单一克本质上是含有抗性基因、单一克隆位点以及隆位点以及DNAcos位点（体外包装所必需）的位点（体外包装所必需）的细菌质粒。细菌质粒。 粘性质粒优点是克隆容量较大，可容纳粘性质粒优点是克隆容量较大，可容纳35kb45kb外源外源DNA，转化率也较高。常用的粘性转化率也较高。常用的粘性粒有粒有PHC79。PJB8、MUA3和和KOSI等，它们等，它们大多具有一种或多种限制性内。切酶的单一酶切大多具有一种或多种限制性内。切酶的单一酶切位点。极其适合

14、高等真核基因的克隆工作。位点。极其适合高等真核基因的克隆工作。 11.3.4 YAC载体酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,）是人工构建的染色体：是人工构建的染色体：目前能插入片段最大的载体。目前能插入片段最大的载体。11.3.5 病毒载体 细菌质粒细菌质粒和和噬菌体噬菌体具有严格的宿主选择性，具有严格的宿主选择性，只能在相应的细菌中生存和繁殖，从而限制了基只能在相应的细菌中生存和繁殖，从而限制了基因工程的广泛性。因工程的广泛性。 动物病毒载体动物病毒载体是一种比较理想的真核基因是一种比较理想的真核基因工程载体，在其序列中往往具有几个很强的启

15、动工程载体，在其序列中往往具有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的核酸序列高产量和高子，它可使排列在其后方的核酸序列高产量和高频率地复制和表达。频率地复制和表达。 SV40 病毒的基因组是共价封闭环状双链病毒的基因组是共价封闭环状双链DNA，长长52kb。基因组在功能上分为早、晚期转录两个基因组在功能上分为早、晚期转录两个区域。区域。 pCATpCATbasic plasmidbasic plasmid在在SV40的调节片段上的调节片段上游插入一个氯霉素乙游插入一个氯霉素乙酸基转移酶酸基转移酶（chloramphenicol acetylfransferase， CAT）11.411.4获取

16、目的基因的方法获取目的基因的方法 11.4.111.4.1鸟枪法鸟枪法 在基因组在基因组DNA文库中筛选出目的基因文库中筛选出目的基因 鸟枪克隆法在基因组鸟枪克隆法在基因组DNA文库中筛选到的文库中筛选到的目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因表达的表达的调控分析调控分析。因为有内含子的存在，这样获。因为有内含子的存在，这样获得的结构基因得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达不宜在原核

17、宿主组织中表达。 11.4.211.4.2化学合成基因化学合成基因 将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段苷酸片段 。11.4.311.4.3聚合酶链式反应聚合酶链式反应 polymerase chain reactionpolymerase chain reaction， PCR PCR优点优点很很多，具有快速、灵敏、简便，特异等特点。多，具有快速、灵敏、简便，特异等特点。 PCR对对 DNA模板的质量和数量要求比其他实验模板的质量和数量要求比其他实验方法低得多方

18、法低得多 但但PCRPCR也有也有缺点缺点：扩增：扩增DNA的长度一般不超的长度一般不超过过 2kb， Taq DNA聚合酶在合成作用时也会发聚合酶在合成作用时也会发生错误，出错率生错误，出错率025，费用比较昂贵。，费用比较昂贵。 11.5 DNA11.5 DNA体外重组与基因转移体外重组与基因转移 11.5.111.5.1体外重组体外重组 将目的基因与载体连接在一起，即将目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。的体外重组。 粘性末端连接粘性末端连接 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接这两种方法不同限制酶切位点连接这两种方法 酶切割产生单链突出的粘性末端酶切

19、割产生单链突出的粘性末端（cohensive terminal） 酶切位点附近的酶切位点附近的DNA序列不影响连接序列不影响连接 两个两个DNA片段一起退火（片段一起退火（anneal）时，时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在粘性末端单链间进行碱基配对，然后在T4 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子分子 体外重组条件与过程体外重组条件与过程连连接接结结果果平端连接 具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。基因连接。 T4 DNA连接酶可催化相同和不同限连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平

20、端之间的连接制性核酸内切酶切割的平端之间的连接 有时载体有时载体DNA片段是平末端，而目的基因片段是平末端，而目的基因却是粘性末端，那就需要进行处理，使载体却是粘性末端，那就需要进行处理，使载体DNA和目的基因的末端一致起来，通常是将目和目的基因的末端一致起来，通常是将目的基因的粘性末端修饰成平末端，即的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补法添补法和和削削除法除法 。人工接头连接 同聚物加尾连接 同聚物加尾连接是同聚物加尾连接是利用同聚物序列之间利用同聚物序列之间的退火作用完成的连的退火作用完成的连接接 11.5.2 11.5.2 基因转移基因转移转化转化( (transformation)tr

21、ansformation)，是将重组质粒导入是将重组质粒导入受体细菌细胞受体细菌细胞转染转染( (transfection)transfection)，是将携带外源基因的是将携带外源基因的病毒感染受体细胞病毒感染受体细胞 微注射技术微注射技术( (microinjection)microinjection) 电转化法电转化法( (electro-transformation)electro-transformation) 微弹技术微弹技术( (micro neblast techniquemicro neblast technique也叫高也叫高速粒子轰击法速粒子轰击法micro projec

22、tormicro projector或基因枪技术或基因枪技术gene blaster technique)gene blaster technique) 脂质体介导法脂质体介导法( (liposome mediated gene liposome mediated gene trans-fer)trans-fer)； 11.6 11.6 重组体的鉴定筛选重组体的鉴定筛选 11.7 11.7 转基因技术转基因技术 转基因动物转基因动物是指以实验方法导入外源基因，是指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。物。 融合法融合法，

23、包括细胞融合，微细胞介导融合等，包括细胞融合，微细胞介导融合等 化学法化学法，包括，包括DNA-磷酸钙沉淀法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法等葡聚糖法、染色体介导法等 物理法物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等胞冻存法等 病毒感染法病毒感染法，包括重组，包括重组DNA病毒感染、重病毒感染、重组组RNA病毒感染等病毒感染等 11.8 11.8 克隆技术克隆技术 生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种，目前应用的主要是后者。和细胞核移植两种，目前应用的主要是后者。 （1）培育优良畜种和生产实验动物；）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物）生产转基因动物 （3）用于细胞和组织替代疗法；）用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种）复制濒危的动物物种 11.911.9基因诊断基因诊断 用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术，水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为称为基因诊断基因诊断 核酸杂交核酸杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应 限制性内切酶酶谱分析限制性内切酶酶谱分析 RFLP