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1、1谷风书苑基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定2谷风书苑基因的种类（1）编码蛋白质的基因）编码蛋白质的基因（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。3谷风书苑一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因例子：例子：苏云金杆菌抗虫
2、基因、人苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因胰岛素基因、人干扰素基因2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成也可以是一些具有也可以是一些具有调控作用的因子调控作用的因子4谷风书苑(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？什么是部分基因文库？如何构建基因文库？如何构建基因文库？为什么要构建基因文库？为什么要构建基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基
3、因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5谷风书苑概念：概念：基因文库基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片段片段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因分别含有这种生物的不同的基因,称为基因称为基因文库文库(genelibrary)6谷风书苑基因组文库基因组文库:基因组文库中包含了一种生物所有的基基因组文库中包含了一种生物所有的基因因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库:基因文库中包
4、含了一种生物的一部分基基因文库中包含了一种生物的一部分基因因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.如如cDNA文库文库7谷风书苑基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系8谷风书苑提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库a.a.直接分离法直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )如何构建如何构建基因文库？基因文库？9谷风书苑某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNA
5、DNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶b.b.反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解如何构建如何构建基因文库？基因文库？10谷风书苑基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较11谷风书苑为什么要构建基因文库？为什么要构建基因文库？目的目的怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢? 便于在便于在不知道目的基因核苷酸序列不
6、知道目的基因核苷酸序列的情况下，的情况下，获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。12谷风书苑概念：概念：PCR全称为全称为_，是，是一项在生物一项在生物_复制复制_的核酸合的核酸合成技术。成技术。条件：条件：_、_、_、_.原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNA片段片段DNA复制复制四种游离脱氧核苷酸四种游离脱氧
7、核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNA聚聚合酶合酶（Taq酶）酶）一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列（前提）（前提）（2）利用）利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因模板模板13谷风书苑过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成 。b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，）：系统温度降低，引物引物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用酶的作用下，合
8、成与模板互补的下，合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链14谷风书苑5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /A AG GC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G 变性变性（90-90-9595） 退火退火(55-(55-65)65) 延伸延伸（70-70-7575）5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物PCRPCR技术扩增目的基因的过程：技术扩增目的基因的过程：15谷风书苑方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n为扩为扩增循环的次数）增循环的次数）结果：结果：指数指数2n使目的基因的片段在短时间内
9、成百万使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增倍地扩增16谷风书苑v（3） 人工合成人工合成也可以根据已知的氨基酸序列合成也可以根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成（化学合成（DNADNA合成仪）合成仪）17谷风书苑2.2.下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利
10、用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A. B. C. D.A. B. C. D.1在已知在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情况下，获取目的序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是基因的最方便方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、CDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚合酶链反应18谷风书苑二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并且可以遗传给下一代同时使目的基因能够表达和发挥作用。同时使目的基因能够表达和发挥作用。19谷风书苑
11、2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?20谷风书苑启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记
12、基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来21谷风书苑 3.目的基因与运载体结合所需的条件有目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶同一种限制酶 具有抗性基因的质粒具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNA连接酶连接酶 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 ATP A BC D4.（多选）一个基因表达载体的构建应包括（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因目的基因B启动子启动子C终止子终止子D标记基因标记基因ABCDD22谷风书苑三、将目的基因导入受体细胞三、
13、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达23谷风书苑1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物
14、，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。24谷风书苑过程：过程：优点：经济、有效优点：经济、有效25谷风书苑（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法26谷风书苑目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 带目的基因受精卵带目的基因受精卵 新性状动物新性状动物2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序
15、：程序：27谷风书苑3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子28谷风书苑四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功29谷风书苑四四 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组能摄入重组DNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分
16、子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？能稳定维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测30谷风书苑(一）一）检测检测转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N1.1.检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针： 放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNA分子分子方法：方法：DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性31谷风书苑变性变性变性变性方法：方法：分子杂交技术分子杂交技术2.检测
17、目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N如果显示出杂交带，就表明待测样品目如果显示出杂交带，就表明待测样品目如果显示出杂交带，就表明待测样品目如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。的基因已经转录。的基因已经转录。的基因已经转录。32谷风书苑提提取取3.检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法：抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗
18、体抗体蛋白质蛋白质出现出现杂交带杂交带脱脱分分化化组组织织培培养养证明：证明：提取蛋白质与提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样毒素蛋白质一样33谷风书苑（二）鉴定（二）鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等、抗病鉴定、活性鉴定等34谷风书苑1基因工程的正确操作步骤是基因工程的正确操作步骤是( )构建基因表达载体构建基因表达载体 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求检测目的基因的表达是否符合特定性状要求获取目的基因获取目的基因A B C D2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是下列有关基因工程技术的叙述，正确的是()A重组重组DNA技术所用的工具酶是
19、限制酶、技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和基因连接酶和基因进入受体细胞的载体进入受体细胞的载体B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C选用细菌作为重组质粒的受体细胞主要是因为细菌繁殖快、选用细菌作为重组质粒的受体细胞主要是因为细菌繁殖快、遗传物质少遗传物质少D只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达35谷风书苑3、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，最主要的原因是为受体细胞，最主要的原因是A结构简单、操作方便结构简单、操作方便B繁殖速度
20、快繁殖速度快C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少性状稳定、变异少4、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌支原体支原体动植物细动植物细胞胞ABCDBD5、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C36谷风书苑6.采用基因
21、工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白的的DNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养ABCDC7.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管道法花粉管道法显微注显微注射法射法胚胎移植胚胎移植DNA分子杂交法分子杂交法ABCDC37谷风书苑A8、应应用用基基因因工工程程技技术术诊诊断断疾疾病病的的过过程程中中必必须须使使用用基基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B38谷风书苑
