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1、临床生化检验反应原理及报告审核检验科检验科 黄小虎黄小虎. *1优选知识全自动生化分析仪全自动生化分析仪. *2优选知识生化分析仪特点优点亮点亮点自动化机械化的仪器设备模仿 代替手工操作提高了工作效率 减少了主观误差灵敏 准确 快速 标准化. *3优选知识生化分析仪分类1按结构原理分管道连续流动式分立式常用离心式干片式急诊常用2按测定速度分小型中型大型超大型（模块式）3按自动化程度分半自动全自动. *4优选知识2004 2004 生化分析仪主要构成生化分析仪主要构成加样系统供排水系统构成构成比色系统光源 比色杯 单色器 检测器数据处理系统样品转盘 试剂仓 取样装置. *5优选知识基本原理临床生
2、化分析仪最常使用的是分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 . *6优选知识. *7优选知识. *8优选知识Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚度成正比 A=kcbA-吸光度 k-吸光系数 c-溶液浓度 b-液层厚度. *9优选知识吸光系数定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测得的吸光度。K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。 . *10优选知
3、识讨论：1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）:入射光为单色光溶液是均匀，无散射溶液2.该定律适用于固体、液体和气体样品3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性，如果 溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）AaAbAc应用：多组分测定. *11优选知识定量分析方法(1) 标准曲线法 (2) 标准溶液对比法(3) 吸光系数法. *12优选知识标准曲线法最经典方法前提：固定仪器和固定条件 A= K*BC 过程：配置标准溶液系列 分别测定 A 得CA曲线 样品 测定A样 查得C样. *13优选知识标准溶
4、液对比法在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的样品溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax ，依据朗伯-比尔定律得: As=Kbcs Ax=Kbcx 则: cx = cs*Ax /AsX. *14优选知识吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式AKbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长 处的吸光系数 或 ,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为： 或. *15优选知识检测方法1.终点法 2.固定时间法3.连续监测法 . *16优选知识终点法 终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对
5、光吸收强度的大小，对物质进行定量的一类分析方法。反应混合物进行一定时间反应后，达到平衡终点，即在显色反应处于稳定阶段时，监测其颜色对光的吸收强度，以此计算待测物浓度。终点时间的确认：一、根据时间-吸光度曲线 如:Trinder（偶联终点比色法）反应测尿酸，反应曲线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定 如:溴甲酚绿法测血清白蛋白 . *17优选知识分类终点法：一点终点法二点终点法免疫比浊法双波长法. *18优选知识一点终点法一点终点法在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时，选择一个时间点测定吸光度值。通常在反应终点附近连续读两个吸
6、光度，求出两点的平均值，并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。. *19优选知识一点终点法的设置：以R和S混合之前的空气空白、水空白或试剂空白的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且成直线，对于反应速度比较快的实验多用。 多见于单试剂项目，如：总蛋白，白蛋白等。. *20优选知识2024/8/1521Am T（时间）（时间）AS+R(吸吸光光度度）一点终点法反应曲线 计算公式： C=(Am-Ab)*KAm-终点读数点的吸光 Ab-试剂空白吸光度 K-校正系数. *21优选知识TP反应曲线蛋白质+Cu2+Cu-蛋白质络合物 550nm处吸收峰. *22
7、优选知识二点终点法第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度Am，经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等的干扰。. *23优选知识AnTAR2AmS+R1(吸吸光光度度）（时间）（时间）两点终点两点终点样本空白样本空白=S+R1S+R1+R2（体积校正因子）（体积校正因子）k0 计计算公式算公式 C=(An-K0*Am)*K . *24优选知识CRE反应曲线肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反应生成红色醌类物质
8、，在540nm处有吸收峰。. *25优选知识Mg反应曲线在碱性溶液中，Mg与二甲苯胺蓝形成重氮盐类的紫色复合物，Mg2+浓度可由二甲苯胺蓝吸光度的下降，通过光度测定法来测定。. *26优选知识免疫比浊法 通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的 方法： 散射比浊：特定蛋白分析仪 透射比浊：自动生化分析仪 通常作两点终点法分析，多采用多点校准。 应用：用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/透射强度与抗原量成正比。. *27优选知识免疫比浊法优点：方法简便结果准确可用于自动化仪器检测
9、缺点：抗体用量大达平衡时间长. *28优选知识双波长法 消除样品中对测定有干扰的物质的影响； 在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长1作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长2 ，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。 试样溶液在2和1两个波长处的吸光度之差，只与待测组分的浓度成正比，而与干扰组分的浓度无关. *29优选知识干扰物质1.脂血：吸收光谱300-600nm呈下降趋势2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰3.胆红素：300-500nm有吸收峰 可见它们的吸收峰都较宽，且同测定波
10、长有重叠现象。. *30优选知识双波长法双波长测定优点 ： 消除噪音干扰 减少杂散光影响 减少样品本身光吸收的干扰 . *31优选知识固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，利用这两点吸光度差值计算结果。 如：苦味酸法测肌酐 计算公式： C=(A2-A1)*KA1A2T(吸吸光光度度）. *32优选知识 测测定定底底物物的的消消耗耗或或产产物物生生成成的的速速度度的的化化学学方方法法称称为为连连续续监监测测法法（又又称称动动态态分分析析法法、速速率率法法或或动动力力学学法法）。在在反反应应速速度度恒恒定定期期（零零级级反反应应期期）来来连连续续
11、观观察察和和记记录录一一定定反反应应时时间间内内底底物物或或产产物物量量的的变变化化。通通过过测测定定一一段段时时间间内内吸吸光光度度的的变变化速率（化速率（ A/min A/min ）来）来计计算待算待测测物的物的浓浓度。度。 酶酶活性活性测测定如（定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用等）常用连续监测法（速率法）连续监测法（速率法）. *33优选知识酶促反应曲线. *34优选知识连续监测法 即零级反应速率法,亦称斜率法 在较长反应时间区段内(90-180秒)，每隔一定时间(530秒)读取一次吸光度值，至 少读取4点，得到3个以上A，最后算出 反应速率A/min。. *35优选知识.
12、*36优选知识酶促反应进程曲线. *37优选知识2024/8/1538A1TAS+R1R2A2(吸吸光光度度）（时间）（时间）连续监测法连续监测法A/min=(A2-A1 )-(空白空白)/(t2-t1)t2t1. *38优选知识连续监测法特点与固定时间法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应。. *39优选知识典型酶联法反应曲线. *40优选知识ALT反应曲线. *41优选知识AMY反应曲线. *42优选知识生化结果报告审核责任心不任心不强，未，未对结果果进行行认真
13、真审核核对检测仪器或器或试剂方法学不方法学不够了解了解工作工作经验不足不足对仪器器检测的的结果及室内果及室内质控控结果果过于相信于相信. *43优选知识1.结合质控判断结果在控在控GLO=TPALB偏高. *44优选知识2.结合临床资料审核结结合病人的性合病人的性别别、年、年龄龄、临临床床诊诊断、其他断、其他检查结检查结果果审审核核 例例：某某病病人人检检测测的的TP为为110g/L，该该标标本本没没有有脂脂血血等等影影响响检测结检测结果的因素果的因素 临临床床诊诊断：多断：多发发性骨髓瘤性骨髓瘤 另：胰另：胰岛岛素与低血糖、病人素与低血糖、病人输输注注药药物物对结对结果的影响果的影响. *4
14、5优选知识检验项目间的内在联系各各检测检测参数参数间间存在大小、比例、存在大小、比例、逻辑逻辑关系关系例：例：TC HDL-C+LDL-C、 TBI DBI CK CK-MB LDH-HBDH. *46优选知识影响检验结果的因素试剂线性范性范围： 了了解解检验项目目试剂的的线性性范范围，对超超过或或低低于于范范围的的项目目，必必须进行行相相应的的减减量量稀稀释或增量后重新或增量后重新测定。定。. *47优选知识线性范围 在在实实际际工工作作中中，用用连连续续监监测测法法会会遇遇到到检检验验结结果果为为0或或者者负负值值的的情情况况，此此时时不不能能盲盲目目相相信信该该结结果低就出具低果低就出具
15、低值报值报告，告，应查应查看其反看其反应应曲曲线线例：某病人的尿液例：某病人的尿液AMY检测结检测结果果为为0U/L 其反其反应应曲曲线线如下如下图图：. *48优选知识AMY反应曲线. *49优选知识AMY反应曲线分析分析：由于分析：由于测定物定物质浓度度过高高处理理：对测定定物物质进行行十十倍倍左左右右的的稀稀释再再测定定，直到反直到反应曲曲线恢复正常恢复正常结果才可靠果才可靠. *50优选知识AMY反应曲线. *51优选知识AMY反应曲线第一次稀释后. *52优选知识检测项目的方法学 分分析析：CK是是由由M和和B两两类类亚亚基基组组成成的的二二聚聚体体，其其构构成成为为CK-MB(心心
16、型型)约约占占0-3%、 CK-MM(肌肌型型)约约占占97-100%、 CK-BB（脑脑型）型）约约占占0-1% . *53优选知识影响检验结果的因素 检测项检测项目的方法学：目的方法学： 要了解要了解该项该项目目试剂试剂采用的方法学：采用的方法学： 例例：某某病病人人在在测测定定心心肌肌酶酶谱谱时时，其其CK:246U/L、CK-MB:286U/L，标标本本无无溶溶血血等等因因素素影影响响,其其结结果中果中CK-MBCK. *54优选知识CK-MB采用的采用的检测检测方法方法为为免疫抑制法免疫抑制法 正正常常人人体体中中，CK同同工工酶酶中中CK-MMCK-MBCK-BB,其其中中CK-B
17、B含含量量极极少少，可可忽忽略略。免免疫疫抑抑制制法法正正是是建建立立于于忽忽略略CK-BB的的基基础础上上。采采用用抗抗体体抑抑制制其其M亚亚基基活活性性，使使CK-MM失失去去活活性性，而而CK-MB失失去去一一半半的的活活性性。单单测测定定B亚亚基基的的活活性性，其其结结果果2即即为为CK-MB活性。活性。由于在患轻度或中度脑损伤、脑血管意外及脑手由于在患轻度或中度脑损伤、脑血管意外及脑手术后术后 造成脑组织发生实质性损害的病人中，造成脑组织发生实质性损害的病人中，CK-BB会升高，这时该方法测定的会升高，这时该方法测定的CK-MB的活性相当的活性相当于是于是CK-MB+2CK-BB的活
18、性之和，造成的活性之和，造成CK-MB活性活性假性升高。假性升高。. *55优选知识检验标本的影响 标标本本脂脂血血会会使使反反应应浊浊度度增增加加，透透光光度度下下降降，吸吸光光度度增增加加，从从而而造造成成检检验验结结果果不不准准确确。如如TP、TG、UA显显著增高，著增高，GGT显显著下降或著下降或为为0 标标本本溶溶血血会会使使K+、ALT、AST、LDH等等检检验验结结果果显显著升高著升高抗凝抗凝剂剂的的错误错误使用使用. *56优选知识仪器性能影响 仪仪器器老老化化、故故障障、清清洗洗管管道道堵堵塞塞、水水质质不不纯纯等等均会均会对检验结对检验结果造成影响果造成影响 光光路路老老化
19、化：表表现现为为CK-MB,ALP,ALT、AST等等项项目目结结果重复性果重复性较较差差 水水质质不不纯纯、反反应应杯杯清清洗洗不不干干净净：表表现现为为无无机机物物质结质结果不准果不准. *57优选知识检验结果的总体趋势 即即使使质质控控在在控控，也也要要注注意意当当日日检检验验结结果果的的总总体的分布体的分布趋势趋势 如如K+的的参参考考区区间间为为3.55.5，中中值值为为4.5，如如果果当当日日结结果果大大部部分分甚甚至至全全部部低低于于4.5，即即使使当当日日质质控控在在控控，任任要要考考虑虑结结果果是是否否偏偏低低，应应重重新新校校准、准、质质控后再控后再测测定定 如如在在质质控
20、控中中TC(-1S),HDL(+1S),LDL(+1S),虽虽然然在在控控，如如出出现现大大部部分分HDL+LDLTC，也也应应考考虑虑重新重新对对三三项项目校目校标标、质质控后再控后再测测定定. *58优选知识总结不要盲目相信不要盲目相信仪仪器器检测检测的的结结果一定准确果一定准确检验检验人人员员要增要增强强对报对报告告审审核的核的责责任心任心检检验验人人员员应应加加强强对对专专业业知知识识的的学学习习和和掌掌握握,了了解解仪仪器的性能及各器的性能及各项项目的方法学和反目的方法学和反应应原理原理对检验标对检验标本的状本的状态态要要认认真确真确认认对对有疑有疑问问或或报报警的警的结结果要果要查查看反看反应应曲曲线线加加强强与与临临床科室的沟通床科室的沟通. *59优选知识. *60优选知识
