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1、第三章第三章免疫分析法免疫分析法一、一、概述概述二、二、抗原抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用五、五、免疫扩散法免疫扩散法主要内容主要内容一、一、概述概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容 免疫学是研究免疫系统的结构与功能免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。一、概述一、概述 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性
2、反应基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。高选择性和低检出限。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。(1)在实验药物动力学和临床药物学中在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2)在药物的临床检测中在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行
3、监测；(3)在药物生产中在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4)对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。在药物分析中，免疫分析法的在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：应用主要集中在以下几方面：免疫分析免疫分析： 利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物.免疫分析方法免疫分析方法非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）标记免疫分析标记免疫分析标记物标记物有无有无非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）
4、酶联免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析免疫分析免疫分析免疫分析检测的发展免疫分析检测的发展放射免疫检测放射免疫检测（兴起于（兴起于2020世纪世纪7070年代年代) )酶联免疫检测酶联免疫检测（兴起于（兴起于2020世纪世纪8080年代，年代，各临床机构普遍使用）；各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术疫检测技术（2020世纪世纪9090年代开始推广使年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。用，产品步入成长期）三个阶段。 特点特点可逆性可逆性比例性比例性反应阶
5、段性反应阶段性特异性特异性免疫分析法的特点免疫分析法的特点特异性特异性特异性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础分子基础: :抗原表位与抗体分子高变区之间抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性空间构型的互补性可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。体均能保持原有的结构和活性。影响因素：影响因素： 抗体抗体对相相应抗原的抗原的亲合力合力亲合力越高，合力越高，结合越合越牢固，越
6、不易解离牢固，越不易解离 环境因素境因素对复合物的影响复合物的影响pH、离子、离子强强度度 比例性和比例性和反应阶段性反应阶段性比例性：比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系量比关系前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适：抗原抗体比例合适 一、概述一、概述二、二、抗原抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容抗原（抗原（antigen,Ag)：
7、是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质抗原的两种特性：免疫原性和抗原性（免疫反抗原的两种特性：免疫原性和抗原性（免疫反应性）性）免疫原性（免疫原性（immunogenicity),能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。免疫反免疫反应性性能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原完全抗原只有抗原性而不具有免疫原性的物质称为半抗原半抗原 半抗原+蛋白质完全抗原赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。体。2.1 定义定义1.抗原的免疫原性抗原的免疫原性抗原物质必须具备
8、的条件：一、异物性二、一定的理化性状三、完整性四、宿主的遗传性一、异物性一、异物性异物是指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类：1、异种物质如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。2、同种异体物质如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。3、自身抗原物质如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。二、一定的理化性状二、一定的理化性状大分子胶体物质凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和结构从化学组成来看，凡含有芳香
9、族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。三、完整性三、完整性具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白四、宿主遗传性四、宿主遗传性 抗原的免疫原性也与机体的应答
10、能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为免疫应答基因（immuneresponse,Ir)。2.抗原的特异性抗原的特异性抗原决定簇（基）载体决定簇和半抗原决定簇共同抗原和交叉反应一、抗原决定簇一、抗原决定簇1、概念抗原决定簇（antigenicdeterminant,AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。2、种类和数量一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD，一种AD决定
11、着一种特异性，多种AD决定着多种特异性3、部位位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。4、大小抗原决定簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。一个蛋白质抗原决定簇含5-7个氨基酸残基一个多糖抗原决定簇含5-7个单糖一个核酸半抗原决定簇含6-8个核苷酸5、抗原结合价（antigenicvalence)是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。半抗原为一价天然抗原的分子结构复杂，分子表面有多个决定簇为多价构象决定簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构象形成的决定簇
12、，多暴露于分子表面。顺序决定簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决定簇，多位于抗原分子内部。功能性AD：分子表面，易被识别。隐蔽性AD：分子内部。B细胞决定簇：分子表面。T细胞决定簇：分子内部。二、二、AD的分类的分类三、共同抗原和交叉反应三、共同抗原和交叉反应两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原。无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异嗜性抗原。一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。2.2 药物分子的抗原性药物分子
13、的抗原性1、药物分子的免疫原性物分子的免疫原性大多数的药物分子通常都是半抗原；一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物也是完全抗原。2、药物分子的抗原特异性物分子的抗原特异性药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白与蛋白质载体合成人工抗原体合成人工抗原进行试验。常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。（1）半抗原和）半抗原和载体体结合的化学反合的化学反应多多肽类激素激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合形成肽键甾体甾体：甾体激素的羟基和酮基不
14、能直接和载体蛋白形成有效的共价键，需要制备甾体的衍生物，通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接在选择结合半抗原的化学反应时，应考虑不同的连接方式可能对抗体的专一性产生不同的影响。半抗原没有可以结合的官能团时需要合成适当的衍生物。为得到特定抗原决定簇相对单纯的合成抗原，需要根据半抗原的化学特性及连接产物的化学特性选择连接的半抗原。（2）半抗原和载体的选择原则）半抗原和载体的选择原则p半抗原选择原则：半抗原选择原则：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的
15、微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。p载体选择原则：载体选择原则：应考虑载体对检测系统的影响：选择的载体应和检测体系不发生交叉反应；用于包被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。免疫过程中考虑载体效应的影响：抗体的特异性依赖于半抗原分子结构中的免疫决定区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反应的性质和量也有影响；应使用相同载体的合成抗原制备半抗原抗体。（3）合成抗原的测定p定性测定方法：定性测定方法：光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导致蛋白构象的改变，改变程度和半抗原的结合量有关，半抗原结合量越大，构象改变程度越大。热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学特征会有变化，
16、差异可通过差示扫描量热法（DCS）等方法测定。p定量测定方法定量测定方法相对含量测定法：通过ELISA法比较半抗原与载体蛋白的相对结合量。绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生反应。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体成为分析试剂抗体成为分析试剂。1、抗体的结构与功能抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋白质泛指与待测
17、分子特异性结合的蛋白质分子分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）,受体（receptor）和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 .抗体（抗体（antibody，Ab）：是由抗原进入机体刺激B细胞分化增殖为浆细胞而合成并分泌的一类能与相应抗原发生特异性结合并产生免疫效应的含有糖基的球蛋白。抗体分布于体液（血液、淋巴液、组织液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清内。 1. 抗体（抗体（antibody, Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、
18、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗体。免疫球蛋白的基本结构 IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。 抗体的基本结构轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为
19、氨基端(N端)和羧基端(C端)。 IgG分子由四条多肽链四条多肽链构成，以二硫键相连以二硫键相连，有三个功能区。抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。Fab：抗原结合片段：抗原结合片段Fc：可结晶片段：可结晶片段胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶巯基乙醇还原巯基乙醇还原巯基乙醇还原巯基乙醇还原胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（C端）裂解片段，F（ab）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应
20、 木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）裂 解 片 段 ， 2个 Fab（ 54KD） ， 一 个Fc（50KD）,Fab与抗原结合，不发生凝集反应。一、多克隆抗体一、多克隆抗体（polyclonal antibodypolyclonal antibody） 1. 定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 2. 实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病（特异性差，可发生
21、超 敏反应） （2）临床诊断二、单克隆抗体二、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAbmonoclonal antibody, McAb） 1. 定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别 抗原分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的 抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特点 具有高度均一性。 3. 杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞无限增殖； 免疫B细胞合成、分泌特异性抗体。 4. 杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。三、基因工程抗体三、基因工程抗体 基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体
22、基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。 人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）； 人改型抗体（reshaped humanized antibody）； 小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。抗体的功能： 清除侵入机体的微生物，寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原。初次反应，再次反应和回忆反应产生抗体。初次反应，再次反应和回忆反应产生抗体。抗体的规律：2抗体作为分析试剂的评价抗体作为分析试剂的评价抗体的特异性抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预
23、处理。有较高的稳定性较高的稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。 3、抗体的制、抗体的制备（1）常规抗血清（多克隆抗体多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。免疫原的制备免疫原的制备免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，
24、经研磨达到油包水的程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。动物免疫动物免疫通常的免疫动物为家兔和羊。免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为110mg或50100mg。试血及效价测定试血及效价测定家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。（2）单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞培养法
25、&接种动物体内生产法制备步骤制备步骤2、抗体的纯化利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。2024/8/1459沉淀分离通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技术。是纯化生物大分子物质常用的经典方法包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。2024/8/1460（一）盐析法在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。优点：成本低，不需要昂贵的设备；操作简便，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用；对pH、温度要求不严格。缺点：
26、分离效果有限2024/8/1461盐析的基本原理盐析的基本原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。2024/8/1462盐类和浓度的选择盐类和浓度的选择p常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等p硫酸铵最为常用硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2mol/L3m
27、ol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。p但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。p高浓度盐析法高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。2024/8/1463脱盐脱盐 蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：透析法透析法超滤法超滤法葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G50G50层析法。层析法。2024/8/1464（二）有机溶剂沉淀法p利用待分离物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分离的方法。p有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液
28、的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。2024/8/1465p优点：优点：分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；溶剂容易除去，并可以回收；沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分离。p缺点：缺点：有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进行；有机溶剂具有一定毒性。2024/8/1466有机溶剂的选择p选择有机溶剂的原则：选择有机溶剂的原则：有机溶剂的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境；不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。p使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。2024/8/1467p残留的有机溶剂去除的方法：残留的有机
29、溶剂去除的方法： 自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行； 凝胶过滤除去。（三）离子交换层析法 离离子子交交换换层层系系（ionexchangechromatography， IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。优点：优点：重现性好，简单易行；分辨力强，回收率高；具有多孔性，表面积大、交换容量大；具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。8/14/202469离子交换法的固定相是离子离子交换法的固定相是离子交换剂；交换剂；若担体带有正电荷，可吸附若担体带有正电荷，
30、可吸附着负电荷分子，则为阴离子着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不以及阳离子则直接流出，不会被吸会被吸附上去。附上去。这些被固相些被固相单体所吸附的离体所吸附的离子，子，统称称为 counter ioncounter ion，因为其电荷与担体上的电荷因为其电荷与担体上的电荷相反相反 (counter (counter 是是 相反相反 的意思的意思) )离子交离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有有许多可多可电离基离基团，根，根据据这些基些基团所所带电荷的不同，可分荷的不同，可分为阴离子交阴
31、离子交换剂和阳离子交和阳离子交换剂。它可分。它可分三部分：高分子聚合物基三部分：高分子聚合物基质、电荷基荷基团和平衡离子。和平衡离子。基本原理基本原理2024/8/1470阳离子交换反应：阳离子交换反应：R-AR-A- - H H+ + + Y + Y+ + R-AR-A- - X X+ + + H + H+ + 阴离子交换反应：阴离子交换反应：R-BR-B+ + OH OH- - + X + X- - R-BR-B+ + X X- - + OH + OH- - R R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A A- - 和和B B+ +分别代表阳离子交换剂和阴离子
32、交换剂中与高分子聚合分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，物共价结合的电荷基团，H H+ + 和和OHOH- -分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，Y Y+ + 和和X X- -分别代表溶液中的离子基团。分别代表溶液中的离子基团。8/14/202471离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管的玻璃管（1.5 cm15 cm）中进行的。中进行的。l含有预被分离的离子含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与
33、离子时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞交换剂上的荷电部位竞争结合。争结合。l任何离子通过柱时的任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度性离子的性质和浓度。8/14/2024722024/8/1473p两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pHpH条件下呈现的条件下呈现的离子状态。离子状态。p大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pHpH（p
34、H6pH68 8）下带负电荷，需用阴离子交）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化换柱纯化，极端的，极端的pHpH下蛋白会变性失活，应尽量避免。下蛋白会变性失活，应尽量避免。 p洗脱可采用改变溶液的洗脱可采用改变溶液的pHpH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pHpH与离与离子强度的方法。改变子强度的方法。改变pHpH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱一般采用改变离子强度的梯度洗脱。p用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度
35、能够中和蛋白柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。 8/14/202474表表3-8 3-8 在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱NaCl(mol/L)NaCl(mol/L)0.01mol/L PB0.01mol/L PB的的pHpH洗脱的蛋白质洗脱的蛋白质0.0250.0258.08.0IgGIgG0.0300.0307.07.0IgGIgG0.0350.0357.07.0IgGIgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、纤维蛋白原0.0400.0407.07.0转铁蛋白、纤
36、维蛋白原转铁蛋白、纤维蛋白原0.0450.0457.07.02 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0500.0507.07.0IgAIgA、2 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0600.0606.56.5IgAIgA、白蛋白、白蛋白0.0700.0706.56.5白蛋白白蛋白0.0800.0806.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、白蛋白脂蛋白、白蛋白0.0900.0906.56.52 2蛋白、珠蛋白、白蛋白蛋白、珠蛋白、白蛋白0.100.106.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白脂蛋白、珠蛋白、白蛋白0.150.156.56.5IgMIgM、-脂蛋白、脂蛋白、球蛋白球蛋白0.20
37、0.206.56.5铜蓝蛋白、铜蓝蛋白、蛋白蛋白2024/8/1475三、技术要点三、技术要点（一）离子交换剂的选择和处理（一）离子交换剂的选择和处理p两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。条件下呈现的离子状态。p大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下下蛋白会变性失活，应尽量避免。蛋白会变性失活，应尽量避免。p处理的目的：使交换剂充
38、分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。 （二）装柱和加样（二）装柱和加样p选择平衡缓冲液的离子强度和选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。p溶液的离子强度常用不影响蛋白
39、质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为度为20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脱和收集（三）洗脱和收集p洗脱可采用改变溶液的洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。与离子强度的方法。改变改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。脱。p用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可
40、以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。洗脱下来。（四）离子交换剂的再生与保存（四）离子交换剂的再生与保存p使其带上所需的平衡离子。使其带上所需的平衡离子。 2024/8/1476（四）亲和层析法亲和层析亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。合特性的一种高度专一的吸附层析类型。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。被亲和分子之间的桥梁。配体本身
41、配体本身必须有两个基团必须有两个基团： 一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变分子的亲和力不会改变 一个能与被亲和分子结合。一个能与被亲和分子结合。8/14/202477亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子 (B) (B) 杂夹在一堆蛋白质当中，杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与鱼饵是与 B B 具有专一性的分子具有专一性的分子 (A, (A, 上图上图 1)1)；A A 与与 B B 的专一性很高，只会在的专一性很高，只会在样本中与样本中与 B B 结合，而排除其它杂质结合，而排除其它杂
42、质 ( (上图上图 2)2)；若把结合在吸着剂上的；若把结合在吸着剂上的 B B 溶溶离下来，就可以得到均质的离下来，就可以得到均质的 B (B (上图上图 3)3)。8/14/2024788/14/202479表表3-16 3-16 亲和层析中部分蛋白配体亲和层析中部分蛋白配体配基配基纯化的物质纯化的物质蛋白蛋白A/A/蛋白蛋白B B各种免疫球蛋白各种免疫球蛋白单克隆抗体单克隆抗体各种抗原、蛋白各种抗原、蛋白A A抗原抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑
43、制剂蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖血凝素、糖苷苷甘酶甘酶生物素生物素亲和素、生物素结合蛋白亲和素、生物素结合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、DNADNA聚合酶、连接组织蛋白聚合酶、连接组织蛋白酶酶钙调蛋白钙调蛋白钙调蛋白结合酶钙调蛋白结合酶TriazineTriazine染料染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等3、特异性抗体的筛选与效价测定、特异性抗体的筛选与效价测定抗体的效价抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀
44、释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。特异性抗体的筛选，特异性抗体的筛选，制备出含不同的抗原决定簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相互作用的强弱进行分析。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用主要内容主要内容四、免疫分析方法及其应用四、免疫分析方法及其应用放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附
45、分析法（ELISA）放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放发展。近年来
46、，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。射分析法更加完善。放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术竞争性体外放射分析技术.基本原理基本原理 基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合结合 , ,这种竞争可用以下反应式来表示：这种竞争可用以下反应式来表示： 抗原抗原抗体抗体常用的标记
47、物：常用的标记物：125I和氚标记物和氚标记物放射性活度（贝克，放射性活度（贝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰变：每秒一次核衰变比活度（比活度（Bp/g）：）：每单位质量所含的放射性比活度每单位质量所含的放射性比活度游离状态游离状态结合状态结合状态具体步骤具体步骤 抗原抗体反应结合的和游离的放射性物质的分离放射性活度的测定柱色谱法柱色谱法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗体发抗抗体发微孔滤膜法微孔滤膜法固相法固相法求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）荧光免疫分析法（光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）免疫荧光技术是将抗原
48、抗体反应的特异性和 敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原荧光免疫分析法（光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位在实际工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术根据实验方法分类直接法间接法补体法其他直接法直接法将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检操作简便、特异性高、
49、非特异性染色少敏感性低抗原标记抗体荧光间接法间接法先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检未知抗原未知抗原未标记未标记抗体抗体标记抗标记抗体体荧光荧光补体法利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光补体补体标记抗标记抗补体抗补体抗体体时间分辨荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。基本原理基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将它采用抗
50、原与抗体的特异反应将待测物待测物与酶连接与酶连接，然后通过，然后通过酶与底物产生颜色反应酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂酶作用的底物（显色剂）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISA）双抗体夹心法，属于非竞争结合测定非竞争结合测定。它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原
51、决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体固相抗体-抗原抗原-酶标抗体免疫复酶标抗体免疫复合物合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。实验原理实验原理 双抗体夹心法双抗体夹心法酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根辣根过氧化物氧化物酶酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸和碱性磷酸酶酶(alkaline phosohatase
52、, AP)。1、HRP催化催化过氧化物的氧化反氧化物的氧化反应。供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nmTMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm2、AP为磷酸磷酸酯酶酶一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应一、一、光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析1 1、酶酶联联免免疫疫吸吸附附分分析析（enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent immun
53、osorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗体使抗原或抗体结合结合到某种到某种固相载体表面固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原酶标抗原或或抗体抗体； 在在测测定定时时，使使受受检检标标本本和和酶酶标标抗抗原原或或抗抗体体按按不不同同的的步步骤骤与固相抗原与固相抗原或固相抗体起或固相抗体起反应反应； 用用洗洗涤涤的的方方法法使使固固相相载载体体上上形形成成的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物与与其其他他物物质质分分开开，结结合合在在固固相相载载体体上上的的酶酶量量与与标标本本中中受受检物质的量成检物质的量成一定的一定的比例比例；
54、 加加入入酶酶反反应应底底物物，底底物物被被酶酶催催化化为为有有色色产产物物，产产物物量量与与标本中标本中受检物受检物的的量相关量相关，用分光光度法进行定量。，用分光光度法进行定量。2 2、ELISAELISA的固相载体的固相载体良良好好的的ELISAELISA板板应应该该是是吸吸附附性性能能好好，空空白白值值低低，孔孔底底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。聚聚氯氯乙乙烯烯对对蛋蛋白白质质的的吸吸附附性性能能比比聚聚苯苯乙乙烯烯高高，但但空空白白值也略高。值也略高。ELISAELISA载体的形式有载体的形
55、式有小试管小试管、小珠小珠和和微量反应板微量反应板。3 3、固相载体的包被与封闭、固相载体的包被与封闭（1 1）包包被被（coatingcoating）指指将将抗抗原原或或抗抗体体连连接接到到固固相相载载体体上的过程。上的过程。以以聚聚苯苯乙乙烯烯微微量量反反应应板板为为例例，通通常常先先将将抗抗原原或或抗抗体体溶溶于于pH pH 9.69.6的的碳碳酸酸盐盐缓缓冲冲液液（或或pH pH 7.27.2的的磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，pH pH 7 78 8的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液）中中，加加满满反反应应孔孔，置置44过夜过夜，洗涤即可。，洗涤即可。包包被被浓浓度度随随载载
56、体体和和包包被被物物的的性性质质可可有有很很大大的的变变化化，每每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为0.10.120g/ml20g/ml。（2 2）封封闭闭（blockingblocking）指指继继包包被被之之后后用用高高浓浓度度的的无无关关蛋白质蛋白质溶液溶液再包被再包被的过程。的过程。封封闭闭就就是是让让大大量量不不相相关关的的蛋蛋白白质质充充填填这这些些空空隙隙，从从而而排斥排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的所有的ELISAELISA固相载体
57、均需封闭固相载体均需封闭。常常用用封封闭闭剂剂有有0.05%0.05%0.5% 0.5% BSABSA；10%10%小小牛牛血血清清或或1%1%明明胶胶；脱脂奶粉脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（，比较价廉，可高浓度使用（5%5%）。）。4 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1 1）稀释液稀释液用于稀释酶标抗体及标本。用于稀释酶标抗体及标本。常常用用中中性性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液，其其中中含含有有无无关关高高浓浓度度蛋蛋白白（如如1010动动物物血血清清、1 1BSABSA（牛牛血血清清白白蛋蛋白白）、1 1明明胶胶等等）和和
58、非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂（如如0.050.05Tween Tween 2020或或TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2）洗洗涤涤液液一一般般与与稀稀释释液液相相同同，常常用用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲液。冲液。四四种种常常用用的的抗抗体体稀稀释释液液和和三三种种常常用用的的洗洗涤涤液液列列于于表表7-7-2 2。编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PB
59、S 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗体稀常用的抗体稀释液和洗液和洗涤液液（3 3）酶反应终止液）酶反应终止液 辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（HRPHRP）反反应应终终止止液液为为2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性条件下丧失酶活性）。在酸性条件下丧失酶活性）。很很多多ELISAELISA试
60、试剂剂采采用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶（APAP）作作为为标标记记酶酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一终止酶反应后，黄色可稳定一段段时间。时间。5 5、ELISAELISA法常用酶的底物系统法常用酶的底物系统ELISAELISA法法对底物的要求对底物的要求：价廉易得价廉易得、安全安全；显色性显色性和和稳定性稳定性好好；底物底物本身最好本身最好为为无色无色物质物质；终止终止酶催化反应后酶催化反应后，底物底物不应再不应再继续地继续地自发性变性自发性变性；其最终其最终产物可溶产物可溶、易于测定易于测定及及光吸收值高光吸收值高。（1 1）辣辣根根过过氧氧化化物物
61、酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻苯苯二二胺胺（OPDOPD，产产物物橙橙红红色色，测测定定波波长长492nm492nm）、5-5-氨氨基基水水杨杨酸酸 （ 5-AS5-AS， 产产 物物 橙橙 色色 ， 测测 定定 波波 长长 550nm550nm） 、3,3,5,5-3,3,5,5-四四甲甲基基联联苯苯胺胺（TMBTMB，产产物物红红色色，测测定定波波长长450nm450nm）、2,2-2,2-连连氮氮- -二二（3-3-乙乙基基苯苯并并噻噻唑唑啉啉- -6-6-磺酸盐磺酸盐）（）（ABTSABTS）等。）等。ABTSABTS的的反应曲线不好反应曲线不好。OPDOPD溶溶液
62、液具具有有光光敏敏性性，相相对对来来说说不不稳稳定定，且且具具有有诱诱变变特性特性。TMBTMB的的背景值低背景值低，溶液，溶液稳定稳定，没有诱变没有诱变特性。特性。（2 2）碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的底底物物系系统统 常常用用的的底底物物为为对对硝硝基基磷磷酸酸苯苯酯酯（PNPPNP），水水解解的的产产物物为为黄黄色色的的对对硝硝基基苯苯酚酚，可可在在405nm405nm处处检检测测其其吸吸光光度度的的变变化化，该该底底物物的的转转化化效效率高，线性关系好率高，线性关系好。用用酚酚酞酞磷磷酸酸酯酯为为底底物物，水水解解生生成成的的酚酚酞酞在在碱碱性性条条件件下下呈红色，可在呈红色，可在530n
63、m530nm处光度法测定处光度法测定。此外还可以此外还可以百里酚酞单磷酸酯百里酚酞单磷酸酯等等为为底物。底物。 （3 3）-D-D-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（ONPGONPG），其其水水解解的的产产物物邻邻硝硝基基苯苯酚在酚在405nm405nm处具有最大吸光度值处具有最大吸光度值。其其他他的的底底物物有有对对硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（PNPGPNPG）、苯苯基基-D-D-半半乳乳糖糖苷苷、氯氯酚酚红红-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（CPRGCPRG）、9-9-羟基羟基-3-3-异吩噁唑酮异吩噁唑酮-D-
64、D-半乳糖苷半乳糖苷（RGRG）等。）等。（4 4）青青霉霉素素酶酶（PNCPNC）的的底底物物系系统统 常常用用底底物物有有溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（BTBBTB）、青青霉霉酮酮酸酸还还原原淀淀粉粉- -碘碘复复合合物物（SICSIC）、溴溴甲甲酚酚紫紫（BCPBCP）和和溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（2 21 1）等。等。二、二、ELISAELISA酶联方法和试验方法酶联方法和试验方法1 1、ELISAELISA酶联方法酶联方法ELISAELISA酶联方法主要有两种，即酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法戊二醛交联法和和过碘过碘酸盐氧化法酸盐氧化法。（1 1）戊二醛交联法戊二醛交联法 戊二醛是一
65、种双功能团试剂，戊二醛是一种双功能团试剂，它可以它可以联结具有氨基的酶和蛋白质联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有戊二醛交联法有一步法一步法、两步法两步法两种。两种。图7-2 戊二戊二醛一步法反一步法反应原理原理一一步步法法 将将戊戊二二醛醛直直接接加加入入酶酶与与抗抗体体的的混混合合物物中中，反反应应后后即即得得酶酶标标记记抗体。抗体。该该法法操操作作简简便便、有有效效，重复性好重复性好。缺缺点点是是交交联联反反应应是是随随机机的的，酶酶与与酶酶、抗抗体体与与抗抗体之间有可能交联。体之间有可能交联。图7-3 戊二戊二醛二步法反二步法反应原理原理两两步步法法 先先将将酶酶与与戊戊二二醛醛作
66、作用用，透透析析除除去去多多余余的的戊戊二二醛醛后后，再再与与抗抗体体作作用用而而形形成成酶酶标标抗抗体体；或或先先将将抗抗体体与与戊戊二二醛醛作作用用，再与酶联结。再与酶联结。两两步步法法的的产产物物中中绝绝大大部部分分的的酶酶与与蛋蛋白白质质是是以以1:1的的比比例例结结合合的的，有有助助于于本底的改善本底的改善。（2 2）过碘酸盐氧化法）过碘酸盐氧化法 本法只适用于本法只适用于含糖量较高含糖量较高的酶。的酶。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）的标记常用此法。）的标记常用此法。反反应应时时，过过碘碘酸酸钠钠将将HRPHRP分分子子表表面面的的多多糖糖氧氧化化为为活活泼泼的的醛基醛
67、基，可与蛋白质上的氨基形成，可与蛋白质上的氨基形成SchiffSchiff氏碱氏碱而结合。而结合。图图7-4 7-4 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法2 2、ELISAELISA试验方法试验方法ELISAELISA法中有三个必要试剂：法中有三个必要试剂：固相抗原固相抗原或抗体；或抗体；酶标记抗原酶标记抗原或抗体；或抗体；酶反应底物酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。如如双抗体夹心法双抗体夹心法、间接法间接法、竞争法竞争法、异种动物抗体双异种动物抗体双夹心法夹心法、抗酶
68、抗体法抗酶抗体法、竞争性抑制法竞争性抑制法、双夹心法双夹心法和和抗抗原直接包被法原直接包被法等方法。等方法。（1 1）双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA）由）由ClarkClark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最经典的年建立，是最经典的ELISAELISA检测法检测法。该法的该法的灵敏度高灵敏度高，特异性强特异性强，但提纯免疫球蛋白和制，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求备酶标记物要求技术性强技术性强，成本较高成本较高。该
69、法该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。，而不能用于半抗原等小分子的测定。图7-5 双抗体双抗体夹心法心法（2 2）间接法间接法间间接接法法（indirect indirect ELISAELISA）是是最最常常用用的的ELISAELISA检检测测方方法法，其其原原理理是是利利用用酶酶标标记记的的抗抗体体和和已已与与固固相相抗抗原原结结合合的受检的受检抗体抗体相结合。相结合。该该法法只只要要更更换换不不同同的的固固相相抗抗原原，就就可可以以用用一一种种酶酶标标抗抗抗体检测抗体检测各种与抗原相应的
70、抗体。各种与抗原相应的抗体。该该方方法法不不必必为为每每个个待待测测抗抗体体（或或抗抗原原）制制备备特特异异性性的的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化简化了实验。了实验。图7-6 间接法接法（3 3）竞争法竞争法竞竞争争法法（competing competing ELISAELISA）是是利利用用待待测测抗抗原原和和酶酶标标抗抗原原与与特特异异性性抗抗体体竞竞争争结结合合，或或待待测测抗抗体体和和酶酶标标抗抗体体与与特特异异性性抗抗原原竞竞争争结结合合而而进进行行测测定定的的一一种种方方法法（图图7-7-7 7）。）。图7-7 竞争法争法（4 4）异种动物抗
71、体双夹心法异种动物抗体双夹心法异异种种动动物物抗抗体体双双夹夹心心法法（图图7-87-8），又又称称间间接接双双抗抗体体夹夹心心法法（indirect indirect DAS-ELISADAS-ELISA）或或三三抗抗体体夹夹心心法法（triple antibodies sandwichtriple antibodies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。此此法法可可用用通通用用的的酶酶标标记记抗抗体体检检验验多多种种病病毒毒，它它不不仅仅免免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。图7-8 异种异种动物抗体物抗体夹心法心法（5
72、 5）抗酶抗体法抗酶抗体法抗抗酶酶抗抗体体法法（图图7-97-9）是是利利用用免免疫疫学学反反应应而而不不是是用用化化学学交交联联反反应应来来制制备备酶酶结结合合物物，常常用用HRPHRP为为标标记记酶酶作作为为抗原抗原免疫动物制备抗免疫动物制备抗HRPHRP抗体抗体。可可用用一一种种动动物物（如如兔兔）制制备备特特异异性性抗抗体体（第第一一抗抗体体）和和抗抗酶酶抗抗体体（第第三三抗抗体体），再再用用另另一一种种动动物物（如如羊羊）制备制备抗第一种动物抗第一种动物（兔）（兔）IgGIgG的抗体的抗体（第二抗体）。（第二抗体）。让让这这种种抗抗IgGIgG的的第第二二抗抗体体把把第第一一抗抗体体
73、（兔兔IgGIgG）和和抗抗酶酶抗体抗体（也为兔（也为兔IgGIgG）通过免疫学反应连接起来。）通过免疫学反应连接起来。最最后后让让酶酶与与抗抗酶酶抗抗体体结结合合，通通过过对对底底物物的的作作用用而而揭揭示示在固相载体上待测抗原的存在。在固相载体上待测抗原的存在。优优点点:HRP:HRP通通过过免免疫疫学学反反应应与与抗抗体体结结合合，避避免免了了用用化化学学方方法法交交联联时时抗抗体体活活性性的的改改变变，也也避避免免了了HRPHRP与与其其他他蛋蛋白白质质分分子子结结合合，防防止止标标记记抗抗体体和和游游离离的的未未标标记记抗抗体体之之间的间的竞争竞争，提高了标记抗体的质量提高了标记抗体
74、的质量。在在纯纯化化化化学学交交联联反反应应制制备备的的酶酶结结合合物物的的过过程程中中，除除去去未未标标记记抗抗体体比比较较困困难难，而而且且该该法法仅仅在在制制备备抗抗酶酶抗抗体体时时用用少少量量纯纯HRPHRP作作抗抗原原，所所以以用用较较粗粗制制的的HRPHRP与与抗抗酶酶抗抗体体形形成成免免疫疫复复合合物物，并并不不影影响响其其质质量量，这这大大大大节节约约了了价价格较昂贵的精制格较昂贵的精制HRPHRP。因因为为制制备备抗抗酶酶抗抗体体必必须须在在动动物物中中进进行行，故故抗抗酶酶抗抗体体法法多多适用于检测动物中的抗体适用于检测动物中的抗体。图7-9 抗抗酶酶抗体法抗体法三三、EL
75、ISA反反应应条条件件的的选择选择1 1、酶标抗体浓度的选择、酶标抗体浓度的选择先先用用200200L L IgGIgG（100 100 mg/mlmg/ml）包包被被小小孔孔，再再将将酶酶标标记记抗抗体体球球蛋蛋白白系系列列稀稀释释并并加加入入小小孔孔中中，洗洗涤涤后后，加加底底物物反反应应，终止终止后后测定测定吸光度。吸光度。选选择择吸吸光光度度为为1 1的的稀稀释释度度作作为为酶酶标标抗抗体体最最适适浓浓度。度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择2 2、包被浓度的选择、包被浓度的选择当包被抗原的当包被抗原的浓度较浓度较低时低时，包被量，包被量随随抗原抗原浓度的增加浓度的增
76、加而而增大增大；当包被抗原当包被抗原达到一定达到一定浓度后浓度后，包被量为定包被量为定值值，不再随抗原浓度，不再随抗原浓度的增加而增大的增加而增大。此浓度称为此浓度称为抗原的饱抗原的饱和包被浓度和包被浓度。图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反反应的关系的关系 表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对包被法中链霉素包被质量浓度对ELISAELISA实验误差的影响实验误差的影响包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果测定结果（A A492492SDSD）（）（n n=4=4）4 41.0981.0980.
77、06280.06281*1*1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.10233 3、酶、酶- -底物反应时间的选择底物反应时间的选择抗抗原原与与抗抗体体、抗抗体体与与酶酶标标抗抗体体反反应应一一般般在在3737反反应应2 23h3h达到高峰。达到高峰。时时间间太太短短，敏敏感感性性下下降降，时时间间太太长长，吸吸附附的的抗抗原原或或复复合物（在这个温度下）可能脱落。合物（在这个温度下）可能脱落。酶酶- -底底物物反反应应时时间间一一般般采采用用15min15min、30min30mi
78、n或或45min45min，也也可可以以标标准准阳阳性性血血清清为为准准，随随时时测测定定其其ODOD值值，当当达达到到规规定的定的ODOD值时，即终止反应值时，即终止反应。四、四、ELISAELISA的定量计算与灵敏度的定量计算与灵敏度1 1、ELISAELISA的定量计算的定量计算一一般般采采用用分分光光光光度度计计测测定定结结合合物物中中的的酶酶量量和和抗抗体体蛋蛋白白（IgGIgG）量，酶量和）量，酶量和IgGIgG计算方法如下。计算方法如下。其其中中，0.40.4表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，酶酶量量为为0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.4
79、2表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，其其相相应应A A280nm280nm值值为为0.420.42；0.620.62表表示示在在A A280nm280nm值值为为1 1时时，IgGIgG量量为为0.62mg/ml0.62mg/ml；0.940.94表示酶、戊二醛结合后，表示酶、戊二醛结合后，A A280nm280nm增加约增加约6 6。酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法：以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法方法：酶量酶量为为1mg/ml1mg/ml，摩尔比值摩尔比值
80、为为1.51.52.02.0，酶结合率酶结合率在在30%30%以上以上时，可获得较好的时，可获得较好的ELISAELISA分析结果。分析结果。2 2、ELISAELISA的灵敏度与的灵敏度与ELISAELISA放大系统放大系统（1 1）ELISAELISA的的灵灵敏敏度度 ELISAELISA的的检检出出限限已已经经达达到到1010-8-81010-12-12g g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。，但对某些测定仍需更高的灵敏度。传传统统ELISAELISA中中显显色色剂剂发发色色团团的的吸吸光光度度是是限限制制ELISAELISA灵灵敏敏度的主要因素度的主要因素。改改用用荧荧光光标标记记或或其
81、其他他化化学学发发光光物物标标记记抗抗体体替替代代酶酶标标记记抗体可以提高灵敏度。抗体可以提高灵敏度。改改变变传传统统ELISAELISA的的操操作作程程序序也也可可以以提提高高灵灵敏敏度度，如如SIMITSIMIT技术。技术。采用放大系统采用放大系统是提高是提高ELISAELISA灵敏度的灵敏度的主要途径主要途径。（2 2）ELISAELISA放放大大系系统统 生生物物素素- -亲亲和和素素放放大大系系统统可可增增加抗体（或抗原）的标记率。加抗体（或抗原）的标记率。生生物物素素与与亲亲和和素素结结合合速速率率较较快快且且结结合合物物的的稳稳定定性性高高（K K=10=101515），不会在孵
82、育和各种洗涤过程中脱落。），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。生生物物素素对对抗抗体体和和酶酶的的标标记记率率高高（1010个个生生物物素素分分子子/ /抗抗体体分分子子），且且生生物物素素分分子子易易于于活活化化，标标记记后后不不影影响响抗抗体和酶的活性。体和酶的活性。每每个个亲亲和和素素分分子子能能结结合合4 4个个生生物物素素，因因而而可可偶偶联联更更多多的联结生物素的酶分子，从而提高的联结生物素的酶分子，从而提高ELISAELISA的敏感性。的敏感性。生生物物素素- -亲亲和和素素标标记记体体系系有有灵灵活活多多变变的的运运用用方方式式，可可以适应不同的分析设计。以适应不同的分析设计。微
83、微粒粒放放大大。用用适适当当的的微微粒粒代代替替酶酶- -抗抗体体结结合合物物也也可可以以获得放大效果。获得放大效果。每每个个微微粒粒表表面面可可以以同同时时结结合合大大量量记记酶酶和和抗抗体体分分子子。在在包包含含微微粒粒放放大大的的夹夹心心ELISAELISA法法中中，微微粒粒通通过过结结合合于于其其上上的的第第二二抗抗体体结结合合于于抗抗原原。微微粒粒上上又又结结合合着着标标记记酶酶，其其数数量量远远比比第第二二抗抗体体能能结结合合的的标标记记酶酶多多，因因此此得得以以放放大。大。例例如如，微微颗颗粒粒放放大大系系统统用用微微颗颗粒粒硅硅胶胶（直直径径约约40nm40nm）作作为为中中间
84、间体体连连接接酶酶和和抗抗体体，避避免免酶酶和和抗抗体体直直接接连连接接。酶酶微微颗颗粒粒硅硅胶胶可可连连接接上上千千个个酶酶分分子子，可可使使体体系系增增敏敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。五、五、ELISA法的应用法的应用酶酶免免疫疫测测定定具具有有高高度度的的特特异异性性和和敏敏感感性性，几几乎乎所所有有的的可可溶溶性性抗抗原原- -抗抗体体系系统统均均可可用用以以检检测测，它它的的最最小小可可测测值达值达ngng甚至甚至pgpg水平。水平。酶酶免免疫疫测测定定在在各各应应用用领领域域中中的的普普及及，应应归归功功于于商商品品试试剂盒
85、和自动或半自动检测仪器的问世。剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。完完整整的的ELISAELISA试试剂剂盒盒应应包包含含包包被被好好的的固固相相载载体体、酶酶结结合物合物、底物底物和和各种浓缩的稀释液各种浓缩的稀释液、缓冲液缓冲液等。等。这这些些试试剂剂在在冰冰箱箱中中可可保保存存半半年年以以上上，因因此此实实验验室室中中只只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。六、六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定基基因因工工程程药药品品在在生生产产过过程程中中
86、为为防防止止污污染染，在在细细胞胞培培养养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。青青霉霉素素在在水水溶溶液液中中很很容容易易和和蛋蛋白白质质结结合合形形成成过过敏敏性性杂杂质质青青霉霉噻噻唑唑（benzyl benzyl penicilloylpenicilloyl，BPOBPO）蛋蛋白白，为为确确保保基基因因工工程程药药品品的的产产品品质质量量，可可以以用用ELISAELISA对对基基因因工工程程药药品品中中是是否否残残存存有有青青霉霉噻噻唑唑蛋蛋白白进进行行检检测测，其其对对样品中结合青霉素的样品中结合青霉素的绝对检出量小于绝对检出量小于0.3100.31
87、0-6-6。其实验步骤如下：其实验步骤如下：（1 1）包包被被：用用碳碳酸酸缓缓冲冲液液（0.1mol/L0.1mol/L，pH pH 9.69.6）直直接接包被包被待测抗原待测抗原，200L/200L/孔；孔；包包被被BPOBPO4 4-CY-CY作作为为阳阳性性对对照照，并并设设有有包包被被抗抗原原不不加加抗抗BPOBPO血清血清和和不包被抗原但加抗不包被抗原但加抗BPOBPO血清血清两组两组阴性对照阴性对照；此此外外，实实验验中中还还设设有有待待测测抗抗原原-BSA-BSA抗抗血血清清相相互互作作用用组组作为作为阴性血清阴性血清对照；对照；44冰箱过夜。冰箱过夜。（2 2）用用洗洗涤涤液
88、液（BPS BPS 0.01mol/L0.01mol/L，pH pH 7.27.2）洗洗涤涤三三次次，每次每次3min3min。（3 3）与与特特异异性性抗抗体体反反应应：在在经经洗洗涤涤好好的的酶酶标标板板中中加加入入稀稀释释至至一一定定滴滴度度的的抗抗BPOBPO血血清清或或抗抗BPOBPO单单克克隆隆抗抗体体，200L/200L/孔，孔，3737保温保温2h2h。（4 4）洗涤洗涤三次。三次。（5 5）与与酶酶联联抗抗抗抗体体反反应应：再再加加入入1 15050稀稀释释的的GAR-IgG-GAR-IgG-HRPHRP 200L/ 200L/孔，孔，3737保温保温1h1h。（6 6）洗涤
89、洗涤三次。三次。（7 7）显色显色：加入：加入OPDOPD底物液，底物液，200L/200L/孔，孔，3737显色。显色。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（8 8）用用1mol/L1mol/L的的硫硫酸酸终终止止反反应应，50L/50L/孔孔，用用酶酶标标仪仪测定其在测定其在492nm492nm波长处的光吸收值。波长处的光吸收值。（9 9）结结果果判判断断：当当阳阳性性孔孔呈呈阳阳性性，阴阴性性血血清清呈呈阴阴性性时时实验成立实验成立。若若当当待待测测抗抗原原的的测测定定结结果果大大于于阴阴性性对对照照均均值值（X X）与与其其2 2倍标准差（倍标准差（SDSD）之和（）之和
90、（X+2SDX+2SD），判为），判为阳性阳性；若小于若小于X+SDX+SD，判为，判为阴性阴性；若在若在X+2SDX+2SD与与X+SDX+SD之间需要调整试验条件之间需要调整试验条件重新测试重新测试。ELISAELISA测测定定125125SerIL-2SerIL-2中中青青霉霉噻噻唑唑蛋蛋白白的的结结果果如如下下（见见表表7-47-4）：）：表表7-4 ELISA实验测定定125SerIL-2*中青霉中青霉噻唑蛋白蛋白DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标
91、分析仪酶标分析仪酶标分析仪一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容l指指可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在与相应抗体在琼脂琼脂介质中相互扩散，介质中相互扩散，彼此相遇，在比例适当处形成彼此相遇，在比例适当处形成沉淀线沉淀线。l根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进行行定性定性分析，也可用于抗体的分析，也可用于抗体的半定量半定量检测检测l本次实验利用此原理进行本次实验利用此原理进行抗体效价抗体效价的测定。的测定。 抗体：抗抗体：抗IgG
92、IgG 抗原：抗原：IgGIgG巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液1.51.5琼脂（巴比妥缓冲液配制）琼脂（巴比妥缓冲液配制）载玻片、打孔器、微量进样器载玻片、打孔器、微量进样器3737水浴箱水浴箱主要的试剂和器材主要的试剂和器材l制板制板 用移液管吸取用移液管吸取4-4.5ml4-4.5ml的琼脂，将其放到的琼脂，将其放到水平放置的载玻片上，待冷凝。水平放置的载玻片上，待冷凝。l打孔打孔 打梅花孔，各孔间的距离为打梅花孔，各孔间的距离为0.7-0.8cm0.7-0.8cm。实验步骤实验步骤1l倍比稀释抗体倍比稀释抗体 （见下表）（见下表）l加样加样 用微量进样器在各孔加样品用微量进样器在各孔加样品10
93、ul10ul，中央孔，中央孔加抗原，周围加抗原，周围6 6孔分别加不同稀释度的抗体孔分别加不同稀释度的抗体l将玻片放在湿盒中将玻片放在湿盒中，37 18-24h37 18-24h123456生理盐水生理盐水2525252525抗抗IgGIgG502525252525l在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线。在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线。实验结果实验结果l将出现白色沉淀线的最高血清稀释度作为该抗体将出现白色沉淀线的最高血清稀释度作为该抗体的效价。的效价。 例：该血清中抗例：该血清中抗IgGIgG抗体的效价为抗体的效价为1 1：4 4。 实验结论实验结论画出实验结果图并判断效价画出实验结果图
94、并判断效价l玻片要清洁，边缘无破损。玻片要清洁，边缘无破损。l浇制琼脂板时要均匀、无气泡。浇制琼脂板时要均匀、无气泡。l孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。l加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果的准确性。的准确性。l注意微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。注意微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。注意事项注意事项思考题思考题1.论述免疫分析法的定义，主要包括哪些方法？2.半抗原、全抗原、合成抗原、抗体、单克隆抗体的定义？3.什么是抗体的效价？测定抗体效价的方法。4.论述制备抗血清的方法要点？5.常用的抗体包括哪两类？并比较它们的特性。6.论述酶联免疫分析法（ELISA）的基本原理与方法步骤
