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1、第三章第三章 蛋白质组研究方法蛋白质组研究方法 Chapter 3 Research Methods Chapter 3 Research Methods in Proteomicsin Proteomics蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术主主 要要 内内 容容蛋白质研究方法的概述蛋白质研究方法的概述大规模的蛋白质分离技术大规模的蛋白质分离技术高通量蛋白质鉴定技术高通量蛋白质鉴定技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术第一节第一节 概述概述蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术一、蛋白质组的研究远比基因组一、蛋白质组的研究远比基因组的研究要复杂的多的研究要复杂的多蛋白质的数目远大于基因的数目：蛋白质的数
2、目远大于基因的数目：基因的拼基因的拼基因的拼基因的拼接和翻译后修饰接和翻译后修饰接和翻译后修饰接和翻译后修饰蛋白质是动态蛋白质是动态/基因是相对静态的基因是相对静态的氨基酸种类远多于核苷酸种类氨基酸种类远多于核苷酸种类技术手段上：技术手段上：基因研究有基因研究有基因研究有基因研究有PCRPCR、DNADNA自动测序自动测序自动测序自动测序技术、技术、技术、技术、DNADNA微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的技术技术技术技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术DNADNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质检测水平检测
3、水平检测水平检测水平/ /灵灵灵灵敏度敏度敏度敏度可用可用可用可用PCRPCR技术扩增技术扩增技术扩增技术扩增检测限约为检测限约为检测限约为检测限约为3030个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝/ /样本样本样本样本无法被扩增无法被扩增无法被扩增无法被扩增检测方法检测方法检测方法检测方法高度特异高度特异高度特异高度特异DNADNA与其互补序列（与其互补序列（与其互补序列（与其互补序列（DNA/RNADNA/RNA）的杂交能力）的杂交能力）的杂交能力）的杂交能力使得使得使得使得DNADNA很容易固相化在靶上并用荧光探针很容易固相化在靶上并用荧光探针很容易固相化在靶上并用荧光探针很容易固相化在靶上并用荧光探针
4、检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现非特异非特异非特异非特异蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或较特异的方法如抗体进行检测较特异的方法如抗体进行检测较特异的方法如抗体进行检测较特异的方法如抗体进行检测分子的稳定分子的稳定分子的稳定分子的稳定性性性性DNADNA是是是是非常稳定非常稳定非常稳定非常稳定的，即使在提高温度的的，即使在提高温度的的，即使在提高温度的的，即使
5、在提高温度的情况下也不丢失生物活性情况下也不丢失生物活性情况下也不丢失生物活性情况下也不丢失生物活性蛋白质在蛋白质在蛋白质在蛋白质在变性情况下将丧失天然功能变性情况下将丧失天然功能变性情况下将丧失天然功能变性情况下将丧失天然功能，需要格外小心保持其天然构象需要格外小心保持其天然构象需要格外小心保持其天然构象需要格外小心保持其天然构象重复性重复性重复性重复性重复性好重复性好重复性好重复性好将将将将DNADNA固相化在表面已经是成熟的技术，加固相化在表面已经是成熟的技术，加固相化在表面已经是成熟的技术，加固相化在表面已经是成熟的技术，加之之之之DNADNA固有的稳定性，方法的重复性较好固有的稳定性
6、，方法的重复性较好固有的稳定性，方法的重复性较好固有的稳定性，方法的重复性较好重复性不好重复性不好重复性不好重复性不好由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性需格外关注复性需格外关注复性需格外关注复性需格外关注消耗消耗消耗消耗初始的投入是较大的（微阵列、扫描仪、初始的投入是较大的（微阵列、扫描仪、初始的投入是较大的（微阵列、扫描仪、初始的投入是较大的（微阵列、扫描仪、共聚焦显微镜），但短期内得到的数据共聚焦显微镜），但短期内得到的数据共聚焦显微镜），但短期内得到的数据共聚焦显微镜），但短
7、期内得到的数据量相当大量相当大量相当大量相当大目前的蛋白质分析方法依赖目前的蛋白质分析方法依赖目前的蛋白质分析方法依赖目前的蛋白质分析方法依赖昂贵昂贵昂贵昂贵的仪的仪的仪的仪器设备（质谱仪、器设备（质谱仪、器设备（质谱仪、器设备（质谱仪、2-DE2-DE装置）装置）装置）装置）专业化专业化专业化专业化方法已相当标准化方法已相当标准化方法已相当标准化方法已相当标准化蛋白质的分析蛋白质的分析蛋白质的分析蛋白质的分析较困难较困难较困难较困难。大部分分析工。大部分分析工。大部分分析工。大部分分析工作如纯化与质谱分析等都需要受过训作如纯化与质谱分析等都需要受过训作如纯化与质谱分析等都需要受过训作如纯化与
8、质谱分析等都需要受过训练的人员来操作练的人员来操作练的人员来操作练的人员来操作时间时间时间时间/ /自动化自动化自动化自动化已成为高通量的扫描技术已成为高通量的扫描技术已成为高通量的扫描技术已成为高通量的扫描技术目前还目前还目前还目前还不能达到工业需求的高通量不能达到工业需求的高通量不能达到工业需求的高通量不能达到工业需求的高通量翻译后修饰翻译后修饰翻译后修饰翻译后修饰无法研究无法研究无法研究无法研究研究翻译后修饰的唯一方法是研究蛋研究翻译后修饰的唯一方法是研究蛋研究翻译后修饰的唯一方法是研究蛋研究翻译后修饰的唯一方法是研究蛋白质本身白质本身白质本身白质本身动态范围动态范围动态范围动态范围5
9、5个数量级个数量级个数量级个数量级7-127-12个数量级个数量级个数量级个数量级DNADNA分析（分析（分析（分析（cDNAcDNA微阵列）与蛋白质分析（微阵列）与蛋白质分析（微阵列）与蛋白质分析（微阵列）与蛋白质分析（2-DE2-DE与质谱）方法的比较与质谱）方法的比较与质谱）方法的比较与质谱）方法的比较蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术二、蛋白质研究技术的发展二、蛋白质研究技术的发展 双向电泳技术：双向电泳技术：双向电泳技术：双向电泳技术：19751975年，年，OFarrelOFarrel建立的；是目前唯一能将建立的；是目前唯一能将数千种数千种蛋白质同时分离与展示蛋白质同时分离与展示蛋白
10、质同时分离与展示蛋白质同时分离与展示的分离技术，一般能分离的分离技术，一般能分离1000 30001000 3000个蛋白质点个蛋白质点 图像分析与大规模数据处理软件图像分析与大规模数据处理软件图像分析与大规模数据处理软件图像分析与大规模数据处理软件 两种软电离质谱技术两种软电离质谱技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight matrix assisted laser desorption
11、 ionization time of flight mass spectrometry, mass spectrometry, MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）与）与电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱（electro-spray ionization mass spectrometry,electro-spray ionization mass spectrometry, ESI-MS ESI-MS）：）：可精确测定生物大分子的可精确测定生物大分子的相对分子质量相对分子质量相对分子质量相对分子质量及及多肽序列多肽序列多肽序列多肽序列，使得，使得微微微微
12、量快速的蛋白质鉴定量快速的蛋白质鉴定量快速的蛋白质鉴定量快速的蛋白质鉴定得以实现得以实现双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术术、质谱技术术、质谱技术术、质谱技术-蛋白质组研究的三大基本支撑技蛋白质组研究的三大基本支撑技蛋白质组研究的三大基本支撑技蛋白质组研究的三大基本支撑技术。术。术。术。蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术三、蛋白质组研究步骤三、蛋白质组研究步骤2-D2-D电泳电泳高效柱层析分离蛋白质高效柱层析分离蛋白质氨基酸组成分析、氨
13、基酸组成分析、C-C-端或端或N-N-端氨基酸序列端氨基酸序列分析及分析及MSMS鉴定所分离的蛋白质鉴定所分离的蛋白质生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析处理、对比和分析蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白样品的蛋白样品的蛋白样品的蛋白样品的IEFIEF和和和和PAGEPAGE电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离生物学问题生物学问题生物学问题生物学问题的提出的提出的提出的提出实验模型实验模型实验模型实验模型的设计的设计的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备样品的制备样品的制备图像扫描和初步分析图像
14、扫描和初步分析图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点蛋白点蛋白点的切取的切取的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验其它实验其它实验的进一步的进一步的进一步的进一步验证验证验证验证蛋白信息的蛋白
15、信息的蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得初步获得初步获得蛋白质组研究策略蛋白质组研究策略蛋白质组研究策略蛋白质组研究策略蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线凝胶中的蛋白胶上原位酶切凝胶中的蛋白胶上原位酶切凝胶中的蛋白胶上原位酶切凝胶中的蛋白胶上原位酶切蛋白质组蛋白质组蛋白质组蛋白质组数据库数据库数据库数据库蛋白质样品的制备（细胞、组织、体液）蛋白质样品的制备（细胞、组织、体液）蛋白质样品的制备（细胞、组织、体液）蛋白质样品的制备（细胞、组织、体液）双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳图像分析、数据
16、处理图像分析、数据处理图像分析、数据处理图像分析、数据处理电转印至膜上的蛋白电转印至膜上的蛋白电转印至膜上的蛋白电转印至膜上的蛋白混合肽混合肽混合肽混合肽氨基酸分析、氨基酸分析、氨基酸分析、氨基酸分析、氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成氨基酸组成EdmanEdman降解、降解、降解、降解、N N端测序端测序端测序端测序肽序列标签肽序列标签肽序列标签肽序列标签肽质量指纹图肽质量指纹图肽质量指纹图肽质量指纹图数据库检索数据库检索数据库检索数据库检索蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSESI-MS-MSESI-MS-MS寡核苷酸合成寡核苷酸合成寡核苷酸
17、合成寡核苷酸合成基因基因基因基因蛋白实验蛋白实验蛋白实验蛋白实验蛋白活性蛋白活性蛋白活性蛋白活性免疫组化免疫组化免疫组化免疫组化蛋白定位蛋白定位蛋白定位蛋白定位抗体抗体抗体抗体肽合成肽合成肽合成肽合成蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术四、新的蛋白质组研究技术四、新的蛋白质组研究技术定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术（isotope-coded affinity tags, ICATisotope-coded affinity tags, ICAT）和双色荧）和双色
18、荧）和双色荧）和双色荧光技术等光技术等光技术等光技术等蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术；物免疫分离与质谱鉴定技术；物免疫分离与质谱鉴定技术；物免疫分离与质谱鉴定技术；蛋白质分离于鉴定：多维色谱质谱联用技术蛋白质分离于鉴定：多维色谱质谱联用技术蛋白质分离于鉴定：多维色谱质谱联用技术蛋白质分离于鉴定：多维色谱质谱联用技术翻译后修饰：蛋白质图谱展示与检测技术翻译后修饰：蛋白质图谱展示与检测技术翻译后修饰：蛋白质图谱展示与检测技术翻译后修饰：蛋
19、白质图谱展示与检测技术蛋白质表达：蛋白质芯片技术蛋白质表达：蛋白质芯片技术蛋白质表达：蛋白质芯片技术蛋白质表达：蛋白质芯片技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术第二节第二节 大规模的蛋白质大规模的蛋白质分离技术分离技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组学的目的蛋白质组学的目的：实现对一个基因组所编：实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的研究码的全部蛋白质及其相互作用的研究首要问题：蛋白质的有效分离首要问题：蛋白质的有效分离理想的蛋白质分离方法：理想的蛋白质分离方法：超高分辨率超高分辨率；可针可针对不同类型的蛋白质对不同类型的蛋白质蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术一、二维凝胶电泳一
20、、二维凝胶电泳1. 2-DE1. 2-DE的介绍：的介绍：的介绍：的介绍：是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与展示的技术展示的技术展示的技术展示的技术1.1 1.1 在在在在2-DE2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向焦电泳中分离，接着被转移到二向焦电泳中分离，接着被转移到二向焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS
21、-SDS-聚丙稀酰胺凝胶上，聚丙稀酰胺凝胶上，聚丙稀酰胺凝胶上，聚丙稀酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离再根据相对分子质量大小不同被分离再根据相对分子质量大小不同被分离再根据相对分子质量大小不同被分离1.2 1.2 固相化固相化固相化固相化pHpH梯度（梯度（梯度（梯度（immobilized pH gradient, IPGimmobilized pH gradient, IPG）等电聚）等电聚）等电聚）等电聚焦电泳技术；微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高焦电泳技术；微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高焦电泳技术；微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高焦电泳技术；微量鉴定技术以及质
22、谱技术灵敏度的提高1.3 1.3 不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重复性以及规模化和自动化的问题等复性以及规模化和自动化的问题等复性以及规模化和自动化的问题等复性以及规模化和自动化的问题等1.4 1.4 改进：改进：改进：改进：2-DE2-DE样品的前处理；样品的前处理；样品的前处理；样品的前处理；2-DE2-DE后的蛋白点的检测研究等后的蛋白点的检测研究等后的蛋白点的检测研究等后的蛋白点的检测研究等蛋白质组研究技术蛋白质组研究技
23、术 第一向进行等电聚焦（第一向进行等电聚焦（第一向进行等电聚焦（第一向进行等电聚焦（isoelectric focusing ,IEFisoelectric focusing ,IEF）, ,由于由于由于由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pHpH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相
24、反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点当蛋白迁移至其等电点当蛋白迁移至其等电点当蛋白迁移至其等电点pHpH位置时，其净电荷数为零，在电位置时，其净电荷数为零，在电位置时，其净电荷数为零，在电位置时，其净
25、电荷数为零，在电场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的焦在一个很窄的焦在一个很窄的焦在一个很窄的pHpH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条梯度介质区域内。目前常使用预制胶条梯度介质区域内。目前常使用预制胶条梯度介质区域内。目前常使用预制胶条（IPGIPG）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPGIPG胶条胶
26、条胶条胶条在含有在含有在含有在含有SDSSDS的缓冲液中平衡的缓冲液中平衡的缓冲液中平衡的缓冲液中平衡 第二向是将在第二向是将在第二向是将在第二向是将在IPGIPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS-PAGESDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，与第
27、一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息得到等电点和分子量的信息得到等电点和分子量的信息得到等电点和分子量的信息蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2.低丰度蛋白、膜蛋白的检测与样品预分离低丰度蛋白、膜蛋白的检测与样品预分离2.1 2.1 低丰度蛋白低丰度蛋白低丰度蛋白低丰度蛋白大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质
28、蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质密码子偏性（密码子偏性（密码子偏性（密码子偏性（ codon bias codon bias）: :指生物体中编码同指生物体中编码同指生物体中编码同指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。密码子偏性系数（密码子偏性系数（密码子偏性系数（密码子偏性系数（ codon bias index codon bias index）: CBI: CBI小小小小于于于于0.20.2的基因编码的蛋白质为低
29、丰度蛋白质。的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。酵母中酵母中酵母中酵母中25002500个编码基因的个编码基因的个编码基因的个编码基因的CBICBI小于小于小于小于0.10.1。蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术一步法（一步法（one-extract-one-gel）：一步提取）：一步提取的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离；高的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离；高丰度蛋白丰度蛋白加大上样量，加大上样量，但有限制但有限制窄范围的窄范围的IPG胶条胶条（2-3个个pH单位）、单位）、非常窄非常窄范围的范
30、围的IPG胶条胶条（约（约1个个pH单位）：可以增单位）：可以增加电泳胶的加电泳胶的分辨率分辨率，加大样品的，加大样品的负载量，负载量，但但存在超出存在超出pH范围的蛋白范围的蛋白去除高丰度的蛋白质去除高丰度的蛋白质蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系银染（银染（银染（银染（1ng1ng）考马斯亮蓝染（考马斯亮蓝染（考马斯亮蓝染（考马斯亮蓝染（100ng100ng）蛋白质的丰度蛋白质的丰度蛋白质的丰度蛋白质的丰度拷贝数拷贝数拷贝数拷
31、贝数/ /细胞细胞细胞细胞蛋白质的量蛋白质的量蛋白质的量蛋白质的量mgmg细胞数细胞数细胞数细胞数蛋白质的量蛋白质的量蛋白质的量蛋白质的量mgmg细胞数细胞数细胞数细胞数101020.07320.0731.2101.2109 92007.32007.31.2101.21011111001002.0072.0071.2101.2108 8200.7200.71.2101.2101010100010000.2010.2011.2101.2107 720.120.11.2101.2109 910 00010 0000.0200.0201.2101.2106 62.02.01.2101.2108 81
32、00 000100 0000.0020.0021.2101.2105 50.20.21.2101.2107 7以以以以6 6 6 6101010107 7 7 7个细胞得到个细胞得到个细胞得到个细胞得到1mg1mg1mg1mg可溶酵母蛋白计算。可溶酵母蛋白计算。可溶酵母蛋白计算。可溶酵母蛋白计算。蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2. 2 膜蛋白膜蛋白膜蛋白是一些膜蛋白是一些疏水性疏水性的蛋白质，在常规的蛋白质，在常规2-DE的提取液中的的提取液中的溶解度低溶解度低，另外因聚焦而，另外因聚焦而产生产生浓缩、聚集浓缩、聚集，从而使得膜蛋白很，从而使得膜蛋白很难融难融解并进入二向解并进入二向SDS-
33、PAGE电泳电泳，因此很难，因此很难被检测到被检测到蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2.3 样品预分离样品预分离（pre-fractionation)2.3.1 分步提取法分步提取法（sequential extraction）原理：蛋白质的溶解度差异原理：蛋白质的溶解度差异采用采用3种不同的提取液种不同的提取液进行进行分步提取分步提取和和分别分别电泳电泳；实际上是增加了；实际上是增加了融解性能融解性能不同的不同的第第三维分离三维分离蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2.3.2 多间隔电离法（多间隔电离法（multi-compartment electrolyser）实质上是一种制备等电聚焦的方
34、法。实质上是一种制备等电聚焦的方法。实质上是一种制备等电聚焦的方法。实质上是一种制备等电聚焦的方法。电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极，由焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极，由焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极，由焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极，由阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将阴阳离子交换膜将
35、电解质与样品分开。操作时，将预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术多间隔电离法示意图多间隔电离
36、法示意图多间隔电离法示意图多间隔电离法示意图蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术3.碱性蛋白质的分离与检测碱性蛋白质的分离与检测3.1 很难被分开：很难被分开：商业化的商业化的商业化的商业化的IPGIPG胶条的胶条的胶条的胶条的pHpH范围通常在范围通常在范围通常在范围通常在3-3-1010，等电点超过，等电点超过，等电点超过，等电点超过1010的蛋白质很难被分开。目前已经有的蛋白质很难被分开。目前已经有的蛋白质很难被分开。目前已经有的蛋白质很难被分开。目前已经有pHpH范围到范围到范围到范围到1212的的的的IPGIPG胶条胶条胶条胶条，从而得到了部分的解决，从而得到了部分的解决，从而得到了部分
37、的解决，从而得到了部分的解决3.2 大部分的细胞提取物是酸性蛋白质大部分的细胞提取物是酸性蛋白质：去除：去除酸性蛋白质改善碱性蛋白质的分离与检测。酸性蛋白质改善碱性蛋白质的分离与检测。可以采用刚才介绍的方法，制备等电聚焦预分离，将碱性可以采用刚才介绍的方法，制备等电聚焦预分离，将碱性可以采用刚才介绍的方法，制备等电聚焦预分离，将碱性可以采用刚才介绍的方法，制备等电聚焦预分离，将碱性蛋白质富集，再采用碱性蛋白质富集，再采用碱性蛋白质富集，再采用碱性蛋白质富集，再采用碱性pHpH梯度胶进行分离梯度胶进行分离梯度胶进行分离梯度胶进行分离蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术4. IPG胶条的改进胶条的改进
38、4.1 4.1 胶条的胶条的胶条的胶条的pHpH范围在不断变窄范围在不断变窄范围在不断变窄范围在不断变窄：改善了：改善了：改善了：改善了2-DE2-DE的分辨的分辨的分辨的分辨率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，而且可以针对不同样品选择不同的胶条而且可以针对不同样品选择不同的胶条而且可以针对不同样品选择不同的胶条而且可以针对不同样品选择不同的胶条4.2 4.2 胶条的胶条的胶条的胶条的pHpH范围也在不断扩大范围也在不断扩大范围也在不断扩大范围也在不断扩大：改善了
39、碱性蛋白：改善了碱性蛋白：改善了碱性蛋白：改善了碱性蛋白质的分离质的分离质的分离质的分离4.3 4.3 不同长不同长不同长不同长度的胶条度的胶条度的胶条度的胶条：通常采用的是：通常采用的是：通常采用的是：通常采用的是18cm18cm的胶条，的胶条，的胶条，的胶条，可以达到可以达到可以达到可以达到20002000种以上蛋白质点的分辨率；种以上蛋白质点的分辨率；种以上蛋白质点的分辨率；种以上蛋白质点的分辨率；24cm24cm、40cm40cm蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术5.高通量与自动化高通量与自动化5.1 5.1 蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化：集蛋白质组研究的高通量需要研究体系的
40、自动化：集蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化：集蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化：集中在中在中在中在2-DE2-DE后的样品处理和蛋白质的识别后的样品处理和蛋白质的识别后的样品处理和蛋白质的识别后的样品处理和蛋白质的识别5.2 5.2 自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操作，缩短了时间，提高了效率；作，缩短了时间，提高了效率；作，缩短了时间，提高了效率；作，缩短了时间，提高了效率；提高了样品处理的提高了样品处理的提高了样品处理的提高了样品处理
41、的重复性重复性重复性重复性，避免了手工操作易产生的污染，避免了手工操作易产生的污染，避免了手工操作易产生的污染，避免了手工操作易产生的污染5.3 5.3 可同时运行可同时运行可同时运行可同时运行1212块胶的二向块胶的二向块胶的二向块胶的二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳槽已经电泳槽已经电泳槽已经电泳槽已经研制成功并商品化研制成功并商品化研制成功并商品化研制成功并商品化蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2-DE2-DE2-DE2-DE，染色，图像分析，染色，图像分析，染色，图像分析，染色，图像分析自动自动自动自动MSMSMSMS样品分析样品分析样品分析样品分析自动蛋白酶解，多肽回收，点样于
42、自动蛋白酶解，多肽回收，点样于自动蛋白酶解，多肽回收，点样于自动蛋白酶解，多肽回收，点样于MSMSMSMS样品靶样品靶样品靶样品靶自动采集数据，数据库检索，蛋白鉴定自动采集数据，数据库检索，蛋白鉴定自动采集数据，数据库检索，蛋白鉴定自动采集数据，数据库检索，蛋白鉴定胶上蛋白点自动切割，置于胶上蛋白点自动切割，置于胶上蛋白点自动切割，置于胶上蛋白点自动切割，置于96969696或或或或384384384384孔板孔板孔板孔板蛋白质识别过程的自动化流程蛋白质识别过程的自动化流程蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术5.4 5.4 分子扫描（分子扫描（分子扫描（分子扫描（molecular scanner
43、molecular scanner）：）：）：）：将一个固相化将一个固相化将一个固相化将一个固相化了胰蛋白酶的了胰蛋白酶的了胰蛋白酶的了胰蛋白酶的PVDFPVDF膜插入膜插入膜插入膜插入2-DE2-DE电泳胶和另一个电泳胶和另一个电泳胶和另一个电泳胶和另一个PVDFPVDF膜之间，后一个膜之间，后一个膜之间，后一个膜之间，后一个PVDFPVDF膜作为收集膜。当对上膜作为收集膜。当对上膜作为收集膜。当对上膜作为收集膜。当对上述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个PVD
44、FPVDF膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿过带有固相化胰酶的过带有固相化胰酶的过带有固相化胰酶的过带有固相化胰酶的PVDFPVDF膜，被第二个膜，被第二个膜，被第二个膜，被第二个PVDFPVDF膜收膜收膜收膜收集。收集膜可直接用于集。收集膜可直接用于集。收集膜可直接用于集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS做肽质量指做肽质量指做肽质量指做肽质量指纹谱分析。纹谱分析。纹谱分析。纹谱分析。实现了实现了实现了实现了2-DE2-DE后的样品处理与
45、质谱分析一体化；后的样品处理与质谱分析一体化；后的样品处理与质谱分析一体化；后的样品处理与质谱分析一体化；肽段肽段肽段肽段数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与鉴定效率受到影响。鉴定效率受到影响。鉴定效率受到影响。鉴定效率受到影响。蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术6. 2-DE的局限性的局限性实验设计：样本间的异质性以及组织中多种实验设计：样本间的异质性以及组织中多种细胞的并存，将影响实验结果的可靠性。细胞的并存，将影响实验结果的可靠性。激激光捕获显
46、微切割的方法（光捕获显微切割的方法（laser-capture microdissection, LCM）：单一细胞）：单一细胞重复性：是重复性：是2-DE方法存在的主要问题方法存在的主要问题动态范围：有限的动态范围与低拷贝蛋白质动态范围：有限的动态范围与低拷贝蛋白质的难以检测也是的难以检测也是2-DE目前尚未完全解决的问目前尚未完全解决的问题。题。放射性同位素标记放射性同位素标记蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术激光捕获显微切割示意图激光捕获显微切割示意图激光捕获显微切割示意图激光捕获显微切割示意图蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质的丢失：疏水性蛋白质、分子质量蛋白质的丢失：疏水性蛋白质、
47、分子质量大于大于100kDa的蛋白质的蛋白质通量和自动化：图像分析仍然是瓶颈通量和自动化：图像分析仍然是瓶颈蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术二、色谱质谱技术二、色谱质谱技术1.1.二维色谱串连质谱技术（二维色谱串连质谱技术（二维色谱串连质谱技术（二维色谱串连质谱技术（2D-HPLC-MS-MS2D-HPLC-MS-MS）1.1 1.1 二维色谱分离蛋白质和多肽二维色谱分离蛋白质和多肽二维色谱分离蛋白质和多肽二维色谱分离蛋白质和多肽优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点2-DE2-DE高分辨率，高分辨率，高分辨率，高分辨率，10001000个蛋白质个蛋白质个蛋白质个蛋白质可得到等电点、相当分子质量信息
48、可得到等电点、相当分子质量信息可得到等电点、相当分子质量信息可得到等电点、相当分子质量信息可得到蛋白质表达谱可得到蛋白质表达谱可得到蛋白质表达谱可得到蛋白质表达谱可平行运行多个胶可平行运行多个胶可平行运行多个胶可平行运行多个胶费时、费力；不易自动化费时、费力；不易自动化费时、费力；不易自动化费时、费力；不易自动化疏水、酸性、碱性、疏水、酸性、碱性、疏水、酸性、碱性、疏水、酸性、碱性、10k200kDa200kDa蛋白易丢失蛋白易丢失蛋白易丢失蛋白易丢失样品负载量受限制样品负载量受限制样品负载量受限制样品负载量受限制2D-2D-HPLCHPLC快速快速快速快速可分离各种蛋白质可分离各种蛋白质可分
49、离各种蛋白质可分离各种蛋白质易于自动化易于自动化易于自动化易于自动化样品在液相；馏分易收集样品在液相；馏分易收集样品在液相；馏分易收集样品在液相；馏分易收集可做样品制备或浓缩可做样品制备或浓缩可做样品制备或浓缩可做样品制备或浓缩不能得到等电点、相对分子质量信息不能得到等电点、相对分子质量信息不能得到等电点、相对分子质量信息不能得到等电点、相对分子质量信息尚未实现平行操作尚未实现平行操作尚未实现平行操作尚未实现平行操作不易得到蛋白质表达谱不易得到蛋白质表达谱不易得到蛋白质表达谱不易得到蛋白质表达谱分辨率不够高分辨率不够高分辨率不够高分辨率不够高2-DE2-DE与与与与2D-HPLC2D-HPLC
50、的比较的比较的比较的比较蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术二维色谱分离蛋白质的优势：二维色谱分离蛋白质的优势：快速；可分离快速；可分离各种蛋白质；样品在液相，馏分易收集；易各种蛋白质；样品在液相，馏分易收集；易于自动化；可做样品制备或浓缩于自动化；可做样品制备或浓缩二维色谱分离蛋白质有多种组合模式：二维色谱分离蛋白质有多种组合模式：第一第一维色谱一般是离子交换色谱维色谱一般是离子交换色谱/凝胶过滤色谱，凝胶过滤色谱，第二维通常是反相色谱第二维通常是反相色谱蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术scx阳离子交换柱阳离子交换柱2D-HPLC分离体系示意图分离体系示意图缓冲液缓冲液废液废液样品样品反相柱反相
51、柱检测器检测器洗液流动相洗液流动相反反相相柱柱1反反相相柱柱2流动相流动相废液废液10通道切换阀通道切换阀蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术1.2 二维色谱串连质谱分离鉴定细胞蛋二维色谱串连质谱分离鉴定细胞蛋白质白质采用二维色谱串连质谱技术可以采用二维色谱串连质谱技术可以对蛋对蛋白质混合物进行直接分离与鉴定白质混合物进行直接分离与鉴定。样本蛋白质混合物样本蛋白质混合物-蛋白酶裂解蛋白酶裂解-二维色二维色谱分离谱分离-质谱分析鉴定蛋白质质谱分析鉴定蛋白质蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术 色谱反相柱色谱反相柱 质谱仪质谱仪串连质谱测序串连质谱测序数据库检索匹配数据库检索匹配 蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白
52、质混合物二维色谱蛋白质混合物二维色谱蛋白质混合物二维色谱蛋白质混合物二维色谱/ /质谱分析流程质谱分析流程质谱分析流程质谱分析流程样品样品蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术优势：优势：识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、碱性蛋白以及相对分子质量大酸性蛋白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质的蛋白质不足：不足：通过蛋白质直接酶切得到的肽段混通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过于复杂，较难实现对细胞全部蛋白合物过于复杂，较难实现对细胞全部蛋白质的识别与鉴定质的识别与鉴定蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2. 同位素标记（同位素标记（ICAT）-亲和色谱亲和色谱-质谱技
53、术质谱技术ICAT，isotope-coded affinity tagging：不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，而且可以大大简化被分析样品的复杂性而且可以大大简化被分析样品的复杂性而且可以大大简化被分析样品的复杂性而且可以大大简化被分析样品的复杂性ICATICAT方法的关键是方法的关键是方法的关键是方法的关键是ICATICAT试剂的应用：试剂的应用：试剂的应用：试剂的应用：半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸生物素标签生物素标签 连接部分连接部分（重链或
54、轻链）（重链或轻链）巯基特异反应基团巯基特异反应基团ICAT试剂示意图试剂示意图蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术n方法：蛋白质进行方法：蛋白质进行ICAT试剂标记试剂标记-蛋白蛋白酶切酶切-亲和色谱分离（只有被同位素标记亲和色谱分离（只有被同位素标记的肽段能被色谱柱保留）的肽段能被色谱柱保留）-进入质谱进行进入质谱进行鉴定鉴定n通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图中信号的强度，中信号的强度，可以实现对差异表达蛋白质可以实现对差异表达蛋白质的定量分析的定量分析，采用串连质谱技术测定肽段的，采用串连质谱技术测定肽段的序列，可以实现蛋白质的序列，可以实现蛋白质
55、的定性鉴定定性鉴定蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术ICATICAT亲和色谱质谱技术流程图亲和色谱质谱技术流程图亲和色谱质谱技术流程图亲和色谱质谱技术流程图蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术优势：优势：可以实现对不同条件处理的细胞差可以实现对不同条件处理的细胞差异蛋白质的定量分析，而且大大简化了被异蛋白质的定量分析，而且大大简化了被分离样品的复杂程度分离样品的复杂程度不足：不足：无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋白质；试剂的高价位白质；试剂的高价位蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术三、一维电泳（色谱）质谱技术三、一维电泳（色谱）质谱技术1.一
56、维一维SDS-PAGE电泳（色谱）质谱分离电泳（色谱）质谱分离鉴定蛋白质复合物鉴定蛋白质复合物蛋白质复合物的蛋白质复合物的蛋白质复合物的蛋白质复合物的分离与鉴定分离与鉴定分离与鉴定分离与鉴定是功能蛋白质组研究是功能蛋白质组研究是功能蛋白质组研究是功能蛋白质组研究的核心内容的核心内容的核心内容的核心内容SDS-PAGESDS-PAGE电泳结合电泳结合电泳结合电泳结合MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技术，或技术，或技术，或技术，或者蛋白酶切结合者蛋白酶切结合者蛋白酶切结合者蛋白酶切结合LC-MS-MSLC-MS-MS技术直接分离和鉴定技术直接分离和鉴定技术直接分离和鉴定技术直接分离
57、和鉴定蛋白质复合物被证明是一种有效的方法蛋白质复合物被证明是一种有效的方法蛋白质复合物被证明是一种有效的方法蛋白质复合物被证明是一种有效的方法蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质复合物一维电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物一维电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物一维电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物一维电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物的分离蛋白质复合物的分离蛋白质复合物的分离蛋白质复合物的分离肽段混合物（溶液中）肽段混合物（溶液中）肽段混合物（溶液中）肽段混合物（溶液中）蛋白质混合物溶液蛋白质混合物溶液蛋白质混合物溶液蛋白质混合物溶液SDS-PAGESDS-PAGEMALDI
58、-TOF-MSMALDI-TOF-MS肽段混合物（胶上）肽段混合物（胶上）肽段混合物（胶上）肽段混合物（胶上）蛋白酶切蛋白酶切蛋白酶切蛋白酶切LC-MS-MSLC-MS-MS蛋白质复合物鉴定蛋白质复合物鉴定蛋白质复合物鉴定蛋白质复合物鉴定数据库检索数据库检索数据库检索数据库检索蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术蛋白质复合物电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质复合物电泳（色谱）质谱分析流程图蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2. 一维一维IEF电泳质谱分离鉴定蛋白质电泳质谱分离鉴定蛋白质与质谱方法相比，与质谱方法相比，与质谱方法
59、相比，与质谱方法相比，SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质相对分测定蛋白质相对分测定蛋白质相对分测定蛋白质相对分子子子子质量误差大，分辨率差，质量误差大，分辨率差，质量误差大，分辨率差，质量误差大，分辨率差，更重要的是，更重要的是，更重要的是，更重要的是，很难获得很难获得很难获得很难获得翻译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息翻译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息翻译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息翻译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量一
60、维一维一维一维IEFIEF电泳质谱：电泳质谱：电泳质谱：电泳质谱：采用采用采用采用IPGIPG胶条进行等电聚焦胶条进行等电聚焦胶条进行等电聚焦胶条进行等电聚焦电泳，电泳，电泳，电泳，MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS对胶条对胶条对胶条对胶条进行表面直接分析进行表面直接分析进行表面直接分析进行表面直接分析。将一向将一向将一向将一向IEFIEF电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分子质量测定技术相结合，误差子质量测定技术相结合，误差子质量测定技术相结合，误差子质量测定技术相结合，误差0.
61、10.1-0.2-0.2蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术第三节第三节 高通量蛋白质鉴高通量蛋白质鉴定技术定技术蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术一、生物质谱技术一、生物质谱技术1. 质谱技术：一百多年的历程，早期的质谱技术分析质谱技术：一百多年的历程，早期的质谱技术分析质谱技术：一百多年的历程，早期的质谱技术分析质谱技术：一百多年的历程，早期的质谱技术分析对象主要是小分子化合物，质量范围在几千以下对象主要是小分子化合物，质量范围在几千以下对象主要是小分子化合物，质量范围在几千以下对象主要是小分子化合物，质量范围在几千以下2. 2020世纪世纪世纪世纪8080年代末期，产生了两项软电离质谱技术年代
62、末期，产生了两项软电离质谱技术年代末期，产生了两项软电离质谱技术年代末期，产生了两项软电离质谱技术ESIESI和和和和MALDI-TOFMALDI-TOF，具有高灵敏度（，具有高灵敏度（，具有高灵敏度（，具有高灵敏度（pmolpmol）和）和）和）和高质量检测范围（几万到几十万高质量检测范围（几万到几十万高质量检测范围（几万到几十万高质量检测范围（几万到几十万DaDa）3. ESI ESI ：采用四级杆质量飞行器，所构成的仪器成为电喷雾：采用四级杆质量飞行器，所构成的仪器成为电喷雾：采用四级杆质量飞行器，所构成的仪器成为电喷雾：采用四级杆质量飞行器，所构成的仪器成为电喷雾（四级杆）质谱仪；其特
63、点之一是可以和液相色谱、毛（四级杆）质谱仪；其特点之一是可以和液相色谱、毛（四级杆）质谱仪；其特点之一是可以和液相色谱、毛（四级杆）质谱仪；其特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现复杂化合复杂化合复杂化合复杂化合物分离与鉴定的联机操作物分离与鉴定的联机操作物分离与鉴定的联机操作物分离与鉴定的联机操作蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术4. 4. MALDI-TOF MALDI-TOF ：常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器常用飞行时间质量分析器，所构
64、成的仪器常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；特点是对盐和特点是对盐和特点是对盐和特点是对盐和填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易
65、高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易解析解析解析解析5. 5. 离子阱离子阱离子阱离子阱（ion trapion trap）质谱仪和傅立叶变换离子回旋共质谱仪和傅立叶变换离子回旋共质谱仪和傅立叶变换离子回旋共质谱仪和傅立叶变换离子回旋共振振振振（fourier transform ion cyclotron resonance, fourier transform ion cyclotron resonance, FTICRFTICR）质谱质谱质谱质谱6. 6. 电喷雾四极杆飞行时间质谱仪电喷雾四极杆飞行时间质谱仪电喷雾四极杆
66、飞行时间质谱仪电喷雾四极杆飞行时间质谱仪：大大提高了仪器大大提高了仪器大大提高了仪器大大提高了仪器的分辨率和灵敏度的分辨率和灵敏度的分辨率和灵敏度的分辨率和灵敏度7. 7. 带有串连质谱功能的带有串连质谱功能的带有串连质谱功能的带有串连质谱功能的MALDI-TOFMALDI-TOF质谱仪质谱仪质谱仪质谱仪：引进了源后：引进了源后：引进了源后：引进了源后裂解或碰撞诱导解离装置，裂解或碰撞诱导解离装置，裂解或碰撞诱导解离装置，裂解或碰撞诱导解离装置，可进行肽序列测定可进行肽序列测定可进行肽序列测定可进行肽序列测定蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术二、二、2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技术胶上蛋白质识别
67、与鉴定技术2-DE2-DE电泳电泳电泳电泳已知蛋白已知蛋白已知蛋白已知蛋白蛋白质胶上原位酶切蛋白质胶上原位酶切蛋白质胶上原位酶切蛋白质胶上原位酶切MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS分析分析分析分析肽质量指纹谱数据库检索肽质量指纹谱数据库检索肽质量指纹谱数据库检索肽质量指纹谱数据库检索蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定ESI-MS-MSESI-MS-MS分析分析分析分析蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定肽序列标签数据库检索肽序列标签数据库检索肽序列标签数据库检索肽序列标签数据库检索蛋白质从头测序蛋白质从头测序蛋白质从头测序蛋白质从头测序新蛋白新蛋白新蛋白新蛋白已知蛋白已
68、知蛋白已知蛋白已知蛋白易于实现高通量易于实现高通量易于实现高通量易于实现高通量特异性高，可实现分离、特异性高，可实现分离、特异性高，可实现分离、特异性高，可实现分离、鉴定一体化操作鉴定一体化操作鉴定一体化操作鉴定一体化操作2 2 2 2- - - -D D D DE E E E胶胶胶胶上上上上蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质鉴鉴鉴鉴定定定定流流流流程程程程图图图图5050606020203030蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术MALDI-TOF-MS：优点是易于实现高通量，：优点是易于实现高通量，适合于胶上蛋白质的高通量、大规模识别与适合于胶上蛋白质的高通量、大规模识别与鉴定；但不适合分析蛋白质混合样
69、品或新蛋鉴定；但不适合分析蛋白质混合样品或新蛋白，且准确度要求较高白，且准确度要求较高蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术nESI-MS-MS：优点是特异性高，且适合混：优点是特异性高，且适合混合样品的蛋白识别与鉴定；与液相色谱相合样品的蛋白识别与鉴定；与液相色谱相连可实现分离、鉴定一体化操作；但分析连可实现分离、鉴定一体化操作；但分析速度慢且操作复杂速度慢且操作复杂蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术三、生物质谱新技术三、生物质谱新技术1.带带MALDI源的四极杆飞行时间质谱源的四极杆飞行时间质谱仪仪(MALDI QqTOF)n将将MALDI离子源与四极杆飞行时间串离子源与四极杆飞行时间串连质谱仪连
70、接，连质谱仪连接，从而实现了样品靶上的同从而实现了样品靶上的同一个样品在同一台质谱仪上的肽质量指纹一个样品在同一台质谱仪上的肽质量指纹谱分析与肽序列标签分析同时进行。谱分析与肽序列标签分析同时进行。n已经成功用于已经成功用于2DE胶上蛋白质的鉴定胶上蛋白质的鉴定蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术2. MALDI-TOF-TOF质谱仪质谱仪n该仪器将该仪器将该仪器将该仪器将MALDI-TOFMALDI-TOF肽质量指纹谱分析的高肽质量指纹谱分析的高肽质量指纹谱分析的高肽质量指纹谱分析的高通量与碰撞诱导解离（通量与碰撞诱导解离（通量与碰撞诱导解离（通量与碰撞诱导解离（collision-induce
71、d collision-induced dissociation, CIDdissociation, CID）获得的丰富碎片信息相结）获得的丰富碎片信息相结）获得的丰富碎片信息相结）获得的丰富碎片信息相结合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接着进行串连质谱分析，着进行串连质谱分析，着进行串连质谱分析，着进行串连质谱分析，使得在微量样品水平上使得在微量样品水平上使得在微量样品水平上使得在微量样品水平上对蛋白质的鉴定在数秒内完成对蛋白质的鉴定在数秒内完成对蛋白质的鉴定在数秒内完
72、成对蛋白质的鉴定在数秒内完成蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术四、结语四、结语 蛋白质组学的研究开辟了功能基因组学研蛋白质组学的研究开辟了功能基因组学研蛋白质组学的研究开辟了功能基因组学研蛋白质组学的研究开辟了功能基因组学研究的新领域。一方面，蛋白质组研究为探索生生究的新领域。一方面，蛋白质组研究为探索生生究的新领域。一方面，蛋白质组研究为探索生生究的新领域。一方面，蛋白质组研究为探索生生命的奥妙提供了崭新的思路和手段；另一方面，命的奥妙提供了崭新的思路和手段；另一方面，命的奥妙提供了崭新的思路和手段；另一方面，命的奥妙提供了崭新的思路和手段；另一方面，蛋白质组研究期待着新的技术方法的突破。随着蛋白质组研究期待着新的技术方法的突破。随着蛋白质组研究期待着新的技术方法的突破。随着蛋白质组研究期待着新的技术方法的突破。随着基因组学与生物信息学技术的发展，政府投资与基因组学与生物信息学技术的发展，政府投资与基因组学与生物信息学技术的发展，政府投资与基因组学与生物信息学技术的发展，政府投资与商业投入的加大，蛋白质组学研究必将在商业投入的加大，蛋白质组学研究必将在商业投入的加大，蛋白质组学研究必将在商业投入的加大，蛋白质组学研究必将在2121世世世世纪取得突破性的进展。纪取得突破性的进展。纪取得突破性的进展。纪取得突破性的进展。蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术
