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1、第34章 DNA的复制本章主要内容本章主要内容一、一、DNADNA的复制的复制 DNADNA聚合酶聚合酶 复制的过程复制的过程 复制的特征复制的特征二、聚合酶链式反应二、聚合酶链式反应 （PCRPCR）三、三、DNADNA的修复的修复DNA聚合反应的特点：聚合反应的特点：需要需要模板模板指导指导以四种以四种dNTP为底物为底物需要有需要有引物引物，3-羟基存在羟基存在DNA链的生长方向是链的生长方向是5 3产物产物DNA的序列的序列与模板互补与模板互补DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase ）温故温故:体体内内终止阶段（终止阶段（Termination ）延伸阶段（延伸阶段（ Elo
2、ngation）起始阶段（起始阶段（Initiation）DNA复制的过程复制的过程SSB温故温故:体体内内DNA复制的特征复制的特征半保留复制半保留复制（semiconservative replication）半不连续复制半不连续复制（semidiscontinuous replication）温故温故:体体内内背景介绍：背景介绍：获得大量的获得大量的DNA化学合成化学合成基因重组基因重组体体外外1983年，美国年，美国Cetus公司的公司的Kary Mullis 发明了聚合酶链式反应（发明了聚合酶链式反应（PCR）。）。二、聚合酶链式反应二、聚合酶链式反应(Polymerase Chai
3、n Reaction,PCR) （一）（一） 定义定义 （二）（二） 发明发明 （三）（三） 基本原理基本原理 （四）（四） 特点特点 （五）（五） 发展和应用发展和应用 知新：知新：体体外外（一）（一）PCR的定义的定义聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)：是一种在是一种在体外体外快速扩增特定基因或快速扩增特定基因或DNADNA序列的方法，序列的方法，故又称为故又称为基因的体外扩增法基因的体外扩增法。体体外外（二）（二） PCR的发明的发明故事发生在1983年4月7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环在试管中模拟
4、细胞内在试管中模拟细胞内DNA的复制的复制DNA聚合酶聚合酶美国黄石国家公园的温泉美国黄石国家公园的温泉 嗜热水生菌嗜热水生菌 Taq DNA聚合酶聚合酶 耐高温耐高温DNA聚合酶聚合酶The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistryKary B. Mullis (1944-) La Jolla, CA, USAMichael Smith (1932-)University of British Columbia Vancouv
5、er, Canada（三）（三）PCR的基本原理的基本原理首先使首先使DNADNA变性变性, ,两条链解开两条链解开, ,然后使引物与模板然后使引物与模板退火退火, ,二者碱基配对二者碱基配对; ; DNADNA聚合酶随即以聚合酶随即以4 4种种dNTPdNTP为底物为底物, ,在引物的引在引物的引导下导下合成合成与摸板互补的新链。与摸板互补的新链。重复重复这个过程，这个过程， DNADNA以以指数方式扩增指数方式扩增。体体外外三个阶段三个阶段高温高温（9095）变性变性( (DenaturationDenaturation) )循环（循环（n n次）次）低温低温（4060）退火退火( (复性
6、复性) )( (A Annealingnnealing) )适温适温（7075）延伸延伸( (ElongationElongation) )动画动画n n次循环后次循环后DNADNA序列扩增的数量序列扩增的数量No. of No. Amplicon Cycles Copies of DNA 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 c
7、ycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon8 cycle = 256 Amplicon扩增的公式：扩增的公式：Y=( 1+X ) n 其中：其中：Y产量；产量；X扩增效率；扩增效率； n循环次数；循环次数； 设设X=60%， n=30， Y =1.33106（四）（四）PCR的特点的特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高简便、快速简便、快速对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低发展：发展： PCR仪的变迁、仪的变迁、PCR的种类的种类应用：应用： 生物学、医学生物学、医学（五）（五）PCR的发展和应用的发展和应用PCR
8、仪仪定性定性定量定量第一代：手动第一代：手动/机械手式机械手式+水浴水浴/电加热电加热PCR仪仪(热循环仪热循环仪) +电泳仪电泳仪+紫外分析仪紫外分析仪+定性试剂定性试剂 第二代：自动化控制型第二代：自动化控制型第三代：终点定量第三代：终点定量PCR仪仪(热循环仪热循环仪) +荧光仪荧光仪+终点荧光定量试终点荧光定量试剂剂 第四代：实时定量第四代：实时定量实时定量实时定量PCR仪实时荧光定量试剂仪实时荧光定量试剂PCR仪的变迁仪的变迁不对称不对称PCR（Asymmertric PCR）嵌套式嵌套式PCR（Nested PCR）原位原位PCRPCR（In situ PCR）逆转录PCR（Rev
9、ersetranscriptionPCR，RT-PCR）实时荧光定量PCR(RealtimefluorescentquantitativePCR，FQPCR)反向PCR（InversePCR）重组PCR（RecombinantPCR）多重等位基因PCR（MultiplexallelePCR）AnchoredPCR;LongfragmentPCR;DDRT-PCR;LM-PCR;RACE;FlowchipPCR;ImmunoPCR;LP-PCR;NASBA;RFLP-PCR;AFLP-PCR;RAPD-PCR;SSCP;TASPCR的种类的种类.PCR的应用的应用生物学生物学基因克隆、人工基因构
10、建、基因克隆、人工基因构建、DNA序列测定、序列测定、基因定点突变、基因型（突变）检测、基因定点突变、基因型（突变）检测、SNP分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、基因表达量研究基因表达量研究（Real-time PCR） 、 基因表达谱研究基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）医学医学临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（肿瘤诊断肿瘤诊断）、）、 病原体检测病原体检测法医学：法医学： 个体识别个体识别、性别鉴定、亲子性别鉴定、亲子鉴定鉴定限制性片段长度多态性PCR法： 限制性内切酶限制性内
11、切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）（癌基因或抑癌基因）检测Ras基因突变正常人患者ExampleExample电电泳泳甲型甲型H1N1流感病毒流感病毒原理：原理：实时荧光定量实时荧光定量逆转录逆转录PCR技术技术 逆转录：逆转录：RNA cDNA耗时：两个半小时耗时：两个半小时病原体检测病原体检测 ExampleExample现嫌1嫌2嫌3在法医鉴定中的应用在法医鉴定中的应用 : 个体识别个体识别ExampleExampleDNA复制复制PCR与生物体的关系与生物体的关系体内体内体外体外模板模板自身自身提取的提取的DNA引物引物RNA引物引物人工合成人工合成DNA引物引物反应条件反应条件常温常温高温变性高温变性低温退火低温退火适温延伸适温延伸酶酶DNA聚合酶聚合酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶产物产物双链、全长双链、全长单链或双链、特定序列单链或双链、特定序列调控调控信息调控信息调控环境环境试比较试比较DNADNA复制与复制与PCRPCR之间的差异之间的差异思考题：思考题：Coming soon:第第34章章 DNA的复制的复制三、三、DNADNA的修复的修复
