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1、蛋白质组学浙江大学浙江大学生命科学学院生命科学学院江江 辉辉密码：密码：shenghua蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白质组学研究思路和技术蛋白质组学研究思路和技术二维电泳质谱技术生物信息学蛋白组学二维电泳(1)课件第二章 二维电泳与蛋白质分离n一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n二、二维等电聚焦二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n三、胶上蛋白质检测技术三、胶上蛋白质检测技术蛋白组学二维电泳(1)课件一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程n意义意义n蛋白质组分析的
2、基础，也是研究工作第一步蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步n制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要n无完全通用技术（技术和大量经验的结合）无完全通用技术（技术和大量经验的结合）n包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）n分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开n提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）n纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品纯化：对提取的蛋白质进一步
3、清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等）（如亲和纯化等）蛋白组学二维电泳(1)课件二维电泳分析中的样品制备二维电泳分析中的样品制备（目标蛋白在细胞中的存在方式）（目标蛋白在细胞中的存在方式）n稳定性（热、稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等）、蛋白酶、化学试剂等）n丰度丰度n定位（膜、细胞质、细胞器等）定位（膜、细胞质、细胞器等）n溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）n分离难易程度分离难易程度n制备变性、活性蛋白制备变性、活性蛋白蛋白组学二维电泳(1)课件二维电泳分析中的样品制备二维电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：n尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免
4、蛋白质损失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法）不同类型的蛋白质需要不同的方法（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法n应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚
5、集和沉淀。白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。n防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。n防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白质氨，以防蛋白质氨甲酰化）。甲酰化）。蛋白组学二维电泳(1)课件n破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链独立的肽链n样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C，不要反复，不要反复冻融样品。冻融样品。n完全去除样品中的核酸和某些干扰
6、蛋白。通过超速离心完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。清除所有的杂质。n主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等脂类、酚类等n尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。研究蛋白的可检测性。蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白质制备流程蛋白质制备流程n分离、提取、纯化分离、提取、纯化n分离：组织或细胞破碎分离：组织或细胞破碎n最大程度的细胞破碎最大程度的细胞破碎n最小程度的蛋白水解或降解最小程度的蛋白水解或降解n提取：
7、分离或沉淀蛋白质（可选择）提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）n去除杂质（去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等类等）n冷冻干燥、沉淀（冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等、丙酮）等n纯化：去除无关杂质（可选择）纯化：去除无关杂质（可选择）n反复提取反复提取n分级提取分级提取蛋白组学二维电泳(1)课件样品类型样品类型n整体样品整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等n组织样品组织样品：器官（肝脏）、植物组织（根、叶）等n细胞（细胞器）样品细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等n可溶性样品可溶性样
8、品：血清、尿液等蛋白组学二维电泳(1)课件细胞裂解的方法细胞裂解的方法n1、温和裂解的方法、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 渗透溶胞法渗透溶胞法非非常常温温和和的的裂裂解解方方法法，可可用用于于进进一一步步进行亚细胞分级。进行亚细胞分级。血血细细胞胞、组组织织培培养养细细胞胞 将将
9、细细胞胞悬悬浮浮于于渗渗透透溶溶胞胞溶溶液液中中，细细胞胞溶溶胀胀而而释释放放出出细胞内容物细胞内容物冻融裂解冻融裂解许许多多类类型型的的细细胞胞可可以以通通过过快快速速反反复复冻冻融得到裂解。融得到裂解。细细菌菌细细胞胞、组组织织培培养养细胞细胞 使使用用液液氮氮，快快速速反反复复冻冻融融至符合实验要求为止。至符合实验要求为止。裂解液裂解裂解液裂解含含去去污污剂剂的的裂裂解解液液处处理理组组织织、细细胞胞以以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。组织培养细胞组织培养细胞将将细细胞胞直直接接置置裂裂解解液液或或样样品液中，进行悬浮处理。品液中，进行悬浮处理。酶裂解
10、酶裂解有有细细胞胞壁壁的的细细胞胞可可以以通通过过酶酶解解去去除除细细胞壁得以温和裂解胞壁得以温和裂解植植物物细细胞胞、细细菌菌细细胞胞、真菌细胞真菌细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮于于专专一一性性酶酶的的等渗溶液中。等渗溶液中。蛋白组学二维电泳(1)课件n2、剧烈的细胞裂解方法、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 超声波处理超声波处理超超声声波波产产生生剪剪切切力力使使细细胞胞破碎破碎 悬浮细胞悬浮细胞要要进进行行间间歇歇处处理理，减减轻
11、轻产产生生热热和和泡泡沫沫，样样品品处处理理应应在在冰冰浴浴中中进行进行 压力杯法（压力杯法（French Press）用用高高压压使使细细胞胞穿穿过过小小孔孔，产生剪切力从而撕破细胞产生剪切力从而撕破细胞 微微生生物物细细胞胞，如如细细菌菌、霉霉菌菌、酵酵母母细细胞胞及及含含有有细细胞胞壁壁的的细胞细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮液液置置于于预预冷冷的的压压力力杯杯中中，施施加加压压力力，然然后后收收集集挤挤出液出液 研磨法研磨法 固固体体组组织织细细胞胞、微微生物细胞生物细胞 组组织织或或细细胞胞预预先先用用液液氮氮冷冷冻冻，然后置瓷研钵中研磨成粉末。然后置瓷研钵中研磨成粉末。加氧化铝或砂有助于
12、研磨加氧化铝或砂有助于研磨 机械匀浆法机械匀浆法（防防止止细细胞胞破破碎碎释释放放出出蛋蛋白酶，引起蛋白质修饰）白酶，引起蛋白质修饰）固固体体组组织织，如如心心脏脏、肝肝脏脏、肾肾脏脏组组织织和和细菌悬液细菌悬液 先先尽尽量量将将组组织织剪剪成成小小块块，然然后后加加有有蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂的的冷冷匀匀浆浆液液进行匀浆，过滤或离心收集。进行匀浆，过滤或离心收集。 蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白质的分离与提取方法蛋白质的分离与提取方法n硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀n高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶n搅拌情况下，缓慢滴
13、加搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白到饱和，离心分离蛋白n三氯乙酸沉淀三氯乙酸沉淀n10-20即可沉淀蛋白；再溶解困难即可沉淀蛋白；再溶解困难n丙酮沉淀丙酮沉淀n常用方法常用方法n加入加入3倍以上体积丙酮，倍以上体积丙酮，-20 C沉淀沉淀2h以上，以上，离心分离蛋白离心分离蛋白n三氯乙酸丙酮沉淀三氯乙酸丙酮沉淀n同时加入三氯乙酸和丙酮，同时加入三氯乙酸和丙酮， -20 C沉淀，沉淀，离心分离蛋白；再溶解困离心分离蛋白；再溶解困难难n苯酚提取甲醇中乙酸铵沉淀苯酚提取甲醇中乙酸铵沉淀n饱和酚提取蛋白，甲醇中用饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用沉淀蛋白，依次
14、用NH4Ac和丙酮和丙酮洗涤沉淀洗涤沉淀蛋白组学二维电泳(1)课件裂解液的组成裂解液的组成n目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性溶解和变性n组成：组成：nIPG缓冲液（缓冲液（IPG buffer）：）：Tris等n离液剂（离液剂（Chaotropic Agents） ：硫脲和尿素 n去污剂（去污剂（Detergents）：）： SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等n还原剂（还原剂（Reducing Agents）：）：-巯基乙醇、DTT或TDF （二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等n两性电解质（
15、两性电解质（Carrier ampholytes）n蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：）：PMSF等蛋白组学二维电泳(1)课件离液剂（离液剂（Chaotropic Agents）n尿尿素素是是最最常常用用的的离离液液剂剂，2mol/L硫硫脲脲和和5-8mol/L尿尿素素联联合合使使用用（硫脲在水中的溶解性很差）（硫脲在水中的溶解性很差）n原理：原理：nNH2-CO-NH2, NH2-CS-NH2 n改改变变或或破破坏坏氢氢键键等等次次级级键键的的结结构构，使使得得蛋蛋白白质质变变性性并并使使蛋蛋白白酶失活酶失活n破破坏坏了了疏疏水水键键（防防止止了了聚聚集集
16、作作用用和和二二级级结结构构的的形形成成，聚聚集集作作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）n硫硫脲脲和和尿尿素素联联合合使使用用，可可以以大大大大增增加加蛋蛋白白质质的的溶溶解解性性，特特别别是是膜蛋白的溶解性膜蛋白的溶解性 n使用注意点：使用注意点： 样品离心前在室温下至少保持样品离心前在室温下至少保持1小时，使完全变性和溶解；样小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同的组成也不同蛋白组学二维电泳(1)课件去污剂（去污剂（Detergents）
17、n破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。电聚焦时析出。 n类型：类型：n离子型：离子型：SDS等等n非离子型：非离子型：TritonX-100、NP-40等等n兼性离子型：兼性离子型：CHAPS(3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propane sulfonate)、ASB-14(Amidosulfobetaine 14)等等n使用注意：使用注意：n原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，
18、这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等不利于等电聚焦。电聚焦。nSDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。初级阶段。 nCHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高浓度脲中的溶解度比较低浓度脲中的溶解度比较低蛋白组学二维电泳(1)课件还原剂（
19、还原剂（Reducing Agents）n断裂蛋白质分子中断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。性。n常用的还原剂有常用的还原剂有-巯基乙醇、巯基乙醇、DTT或或TDF （二硫赤藓糖）和三丁（二硫赤藓糖）和三丁基膦基膦(TBP)等。等。nDTT是使用比较广泛的还原剂。是使用比较广泛的还原剂。50mmol/L时能有效地还原大时能有效地还原大部分的二硫键部分的二硫键 n使用注意点：使用注意点：nDTT的的pKa在在8左右，如果过分提高左右，如果过分提高DTT的浓度会影响到的浓度会影响到pH梯梯度。度。nDTT在碱性在碱性pH值下会发生
20、去质子化，在等电聚焦时，向阳极值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足。导致二硫键复原，蛋损耗而不足。导致二硫键复原，蛋白质沉淀。白质沉淀。 n非离子型还原剂非离子型还原剂TBP则比则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。蛋白组学二维电泳(1)课件两性电解质（两性电解质（Carrier ampholytes）n防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，
21、提高极性蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。端蛋白质的聚焦效果。n吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。n离心时还有助于核酸的沉淀。离心时还有助于核酸的沉淀。n阻止样品蛋白质和阻止样品蛋白质和IPG 胶条中固相化的两性电解胶条中固相化的两性电解质相互作用。质相互作用。蛋白组学二维电泳(1)课件两性电解质对蛋白溶解性和两性电解质对蛋白溶解性和2-DE分辨率的影响分辨率的影响 pI 3.5 pI 9.5 pI 3.5 pI 9.5A：0.5两性电解质 B：2.0两性电解质 蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解蛋白酶
22、抑制剂防止蛋白酶裂解防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可
23、能改变蛋白质的逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为浓度为1M，作用对象为金属蛋白酶。，作用对象为金属蛋白酶。蛋白组学二维电泳(1)课件（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。中。 亮抑酶肽：在亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。 胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。 抑蛋白酶抑蛋白酶A肽：作
24、用对象为丝氨酸蛋白酶。肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。 苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为0.1-0.15mM，能不可逆灭活丝，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。蛋白组学二维电泳(1)课件清除影响二维电泳图谱的杂质清除影响二维电泳图谱的杂质（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐盐等等带带电电物物质质会会干干扰扰电电泳泳过过程程、增增大大溶溶液液电电导导率率，通通常常用
25、用透透析析、凝凝胶过滤、沉淀胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。（2）内源性小分子）内源性小分子这这些些物物质质通通常常带带负负电电，使使阳阳极极侧侧的的聚聚焦焦不不全全，可可采采用用丙丙酮酮/TCA沉沉淀淀去除。去除。（3）离子去污剂）离子去污剂SDS等等离离子子去去污污剂剂，易易和和多多肽肽形形成成复复合合物物而而干干扰扰IEF，-200C的的丙丙酮酮溶液可除去。溶液可除去。蛋白组学二维电泳(1)课件（4）核酸）核酸核核酸酸增增加加样样品品黏黏度度，导导致致二二维维电电泳泳背背景景发发散散；能能与与蛋蛋白白质质结结合合，阻阻碍碍聚聚焦焦；银银 染染
26、 时时 出出 现现 高高 背背 景景 。 加加 0.1V的的 核核 酸酸 酶酶 溶溶 液液 (1mg/ml DNAase+0.25 mg/ml RNAase+50mM MgCl2)冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。 （5）多糖）多糖多多糖糖能能阻阻碍碍凝凝胶胶孔孔径径、与与蛋蛋白白质质形形成成复复合合物物、延延长长聚聚焦焦时时间间、可可能能出出现现水水平条纹，可用平条纹，可用(NH4)2SO4或苯酚或苯酚- NH4Ac沉淀后离心，或用超速离心去多糖。沉淀后离心，或用超速离心去多糖。（6）脂类）脂类脂脂类类易易和和膜膜蛋蛋白白结结合合成成复复
27、合合物物，改改变变蛋蛋白白溶溶解解性性、等等电电点点和和分分子子量量，采采用用大量去污剂可除去。大量去污剂可除去。 （7）酚类）酚类通通常常出出现现在在植植物物组组织织中中，通通过过氧氧化化反反应应修修饰饰蛋蛋白白质质，可可加加还还原原剂剂抑抑制制氧氧化化，也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白质的分级提取蛋白质的分级提取n在在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上样量及电泳后染质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上
28、样量及电泳后染色方法的灵敏度。色方法的灵敏度。n为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。解性的顺序提取法等。n应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得1000-2000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质
29、点。点。n主要分步提取策略：主要分步提取策略：n蛋白质溶解度蛋白质溶解度n蛋白质细胞定位蛋白质细胞定位n蛋白质亲和力蛋白质亲和力 蛋白组学二维电泳(1)课件分步提取法（溶解性差异）分步提取法（溶解性差异）1998年年 Molley提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线:1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质 5-15mg细胞细胞+2ml裂解液裂解液I（40mM Tris）反复冻融反复冻融3-4循环循环加适量加适量DNase I和和 RNase A震荡混均、离心收震荡混均、离心收集上清（沉淀留下一步）集上清（沉淀留下一步） 、冷冻干燥，得
30、提取物、冷冻干燥，得提取物I。2、含、含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白水性蛋白 第一步沉淀物第一步沉淀物+50l 裂解液裂解液II剧烈震荡混均，离心收集剧烈震荡混均，离心收集上清（沉淀留下一步），得提取物上清（沉淀留下一步），得提取物II。裂解液裂解液II：8 M Urea (解聚剂)、4% CHAPS (表面活性剂)、100mM DTT(还原剂)、 40mM Tris 、0.5% Pharmalyte3-10 、20 g/ml DNase I 、 5 g/ml RNase A蛋白组学二维电泳(1)课件3、含硫脲、含硫脲/S
31、B3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白溶液的提取，溶解疏水性蛋白 第二步沉淀物第二步沉淀物40mM Tris清洗清洗200l 裂解液裂解液III 溶解溶解剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于-70 。裂解液裂解液III：5 M Urea 、 2 M Thiourea (解聚剂) 、2% CHAPS 、 2%SB3-10 (表面活性剂) 、2mM TBP(还原剂)、 40mM Tris 、0.5% Pharmalyte3-10 、20 g/ml DNase I 、 5 g/ml RNase A 。对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图对大部分细胞提
32、取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器谱，最后一步因膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法，效果将更好。分级提取，再联合上述方法，效果将更好。蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件ReadyPrep Sequential Extraction Kit （BioRad公司）SAMPLEResidue 1Solution 1，50mlTris, pH 9.5SupernatantResidue 2Solution 2，10mlUrea/CHAPS/TrisBio-Lyte / TBPResidue 3Soluti
33、on 3，10mlUrea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte / TBP4080%1249%58%1% 6%SupernatantSupernatant蛋白组学二维电泳(1)课件亚细胞器蛋白质的提取亚细胞器蛋白质的提取1 1、细胞中亚细胞器的分离、细胞中亚细胞器的分离 据据亚细胞器亚细胞器的大小、形状、密度的差异，利用差速离的大小、形状、密度的差异，利用差速离心和密度梯度离心进行分离。细胞破碎后，先低速离心心和密度梯度离心进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清从胞质溶液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随
34、后对上清溶液进行密度梯度分离，得到线粒体、溶液；随后对上清溶液进行密度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进行分离溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进行分离提取。提取。蛋白组学二维电泳(1)课件差速离心差速离心n在密度均一的介质中不同颗粒大小的物质在不在密度均一的介质中不同颗粒大小的物质在不同的离心力作用下沉降而分离同的离心力作用下沉降而分离n不同细胞器有不同的大小和沉降特性不同细胞器有不同的大小和沉降特性蛋白组学二维电泳(1)课件不同细胞器的大小和沉降特性不同细胞器的大小和沉降特性蛋白组学二维电泳(1)课件差速离心差速离心n差速离心形成的沉淀（肝脏）差速离心形
35、成的沉淀（肝脏）蛋白组学二维电泳(1)课件密度梯度离心密度梯度离心n用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，通过一定的离心力的作用使得细胞器进梯度，通过一定的离心力的作用使得细胞器进行分层分离。行分层分离。1.速度沉降：密度相近但大小不等速度沉降：密度相近但大小不等2.等密度沉降平衡：密度不等的物质等密度沉降平衡：密度不等的物质蛋白组学二维电泳(1)课件1、速度沉降、速度沉降n生物颗粒在一定的密度梯度介质中按照生物颗粒在一定的密度梯度介质中按照各自的沉降系数（各自的沉降系数（S）以不同的速度沉降。）以不同的速度沉降。n必须在沉降最快的生物颗粒到达管
36、底前停止必须在沉降最快的生物颗粒到达管底前停止沉降，并将各部分收集沉降，并将各部分收集n通常在密度较低的介质中进行，一般不需要通常在密度较低的介质中进行，一般不需要高速离心高速离心n牛血清、牛血清、Ficoll（聚蔗糖）、白蛋白等（聚蔗糖）、白蛋白等蛋白组学二维电泳(1)课件2、等密度沉降平衡、等密度沉降平衡n生物颗粒的在连续或不连续梯度的介质中经足生物颗粒的在连续或不连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间沉降到与其自身密度够大离心力和足够长时间沉降到与其自身密度相等的介质处，并停留在该处达到平衡，从而相等的介质处，并停留在该处达到平衡，从而将不同密度的生物颗粒分离。将不同密度的生物颗粒分
37、离。n介质密度较高，介质的最高密度大于分离组介质密度较高，介质的最高密度大于分离组分的最大密度，密度具有一定的陡度分的最大密度，密度具有一定的陡度n离心力比较大，离心时间长离心力比较大，离心时间长nFicoll、Percoll（细胞分离液（细胞分离液 ）、）、Metrizamide（甲泛葡胺（甲泛葡胺 ）等）等蛋白组学二维电泳(1)课件纯纯化化不不同同细细胞胞器器所所推推荐的梯度和离心条件荐的梯度和离心条件 缩写：缩写： (NUC)细胞核；细胞核； (PMS)大片细胞大片细胞膜；膜； (MTT)线粒体；线粒体； (LYS)溶酶体；溶酶体； (PER)过氧化物酶体；过氧化物酶体； (PMV)细胞
38、细胞膜小泡；膜小泡； (SER)滑面内质网；滑面内质网； (RER)粗面内质网；粗面内质网； (END)核内体；核内体； (SARCRT)肌质网；肌质网； (NUCMB)核膜；核膜； (OUTER MITMB)线粒体外膜；线粒体外膜； (INNER MITMB)线粒体内膜；线粒体内膜； (HOM)匀浆物；匀浆物； (dc)非连续；非连续； (c)连续。连续。 蛋白组学二维电泳(1)课件特殊细胞器的提取特殊细胞器的提取1、膜蛋白的提取、膜蛋白的提取（1）膜蛋白的定义：与膜相关的蛋白，如脂）膜蛋白的定义：与膜相关的蛋白，如脂双分子层嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占双分子层嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜
39、蛋白占细胞总蛋白约细胞总蛋白约30%，在细胞生命活动中起重要，在细胞生命活动中起重要作用（如信号蛋白、黏附蛋白、载体蛋白），作用（如信号蛋白、黏附蛋白、载体蛋白），许多膜蛋白是药物作用靶标。许多膜蛋白是药物作用靶标。蛋白组学二维电泳(1)课件（2）膜蛋白提取注意点）膜蛋白提取注意点A、膜蛋白的纯度、膜蛋白的纯度与膜粘连的细胞器可能部分分离出来造成假性，故用与膜粘连的细胞器可能部分分离出来造成假性，故用KBr溶液或用溶液或用更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜蛋白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的
40、一相。蛋白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。B、膜蛋白的特性、膜蛋白的特性低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件a、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对IEF的干扰。的干扰。b 、必须以一种可溶的形式（通常是去污剂、必须以一种可溶的形式（通常是去污剂-蛋白复合物）从膜中分蛋白复合物）从膜中分离出来。离出来。c、所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中（特别
41、在等电点附近）、所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中（特别在等电点附近）保持可溶状态。保持可溶状态。新的去污剂、对疏水蛋白强溶解的裂解液使膜蛋白提取进一步完善，新的去污剂、对疏水蛋白强溶解的裂解液使膜蛋白提取进一步完善，毫克级上样量的二维电泳设备提高了分离的可靠性。毫克级上样量的二维电泳设备提高了分离的可靠性。蛋白组学二维电泳(1)课件2、核蛋白的提取、核蛋白的提取（1）核基质的提取）核基质的提取 A、核基质定义：非染色体结构蛋白及细胞核径向高盐离子、核基质定义：非染色体结构蛋白及细胞核径向高盐离子、核酸酶、去污剂抽提所剩的核蛋白网上结构，包括核纤维蛋核酸酶、去污剂抽提所剩的核蛋白网上结构，包括
42、核纤维蛋白、低丰度核蛋白、核内核糖核蛋白及白、低丰度核蛋白、核内核糖核蛋白及DNA结合区。结合区。 B、提取步骤：、提取步骤： 细胞核在含细胞核在含0.5% Triton100和和1.2mM蛋白抑制剂的缓蛋白抑制剂的缓冲溶液中匀浆数分钟冲溶液中匀浆数分钟 离心去脂类和可溶性蛋白离心去脂类和可溶性蛋白 取取沉淀沉淀,与提取液与提取液4反应反应15min 离心除可溶性骨架蛋白离心除可溶性骨架蛋白取沉淀在消化液内室温消化取沉淀在消化液内室温消化30min 离心得核基质蛋白离心得核基质蛋白和中间丝和中间丝 再溶于含再溶于含8M尿素的裂解液中尿素的裂解液中 透析除尿素透析除尿素 离心得上清夜即为细胞核基
43、质蛋白。离心得上清夜即为细胞核基质蛋白。 提取液：100mM KCl+3mM MgCl2 + 0.5% TritonX-100+12mM PMSF 消化液：50mM NaCl+3mM MgCl2 + 100g/ml DNase I+ 100g/ml RNase A。蛋白组学二维电泳(1)课件（2）核膜蛋白的提取）核膜蛋白的提取A、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白复合物，、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白复合物，不能用去污剂提取，通常用分级制备法得到：细胞核用冰TP缓冲溶液匀浆4下搅拌90min、离心（1000g） 30min 取沉淀用STM0.25 缓冲溶液重悬即得核膜蛋白提取
44、液。 B、进一步分级提取：、进一步分级提取：核膜蛋白提取液+ TritonX-100 （终浓度0.5%）或 NaCl （终浓度1M ）或 Urea （终浓度4M） 4震荡15min 13000rpm离心可得TX抗性蛋白及NaCl洗脱蛋白 50000rpm离心可得离液剂抗性物质 C、常用溶液、常用溶液 TP缓冲溶液：10mM Tris-HCl pH7.4 + 10mM NaH2PO4 + 1mM PMSF+10 g/ml aprotinin + 10g/ml leupeptin + 250 g/ml heparin+ 1mM Na3VO4 + 10mM NaF+400U Benzon uclea
45、se STM0.25 缓冲溶液: 20mM Tris-HCl pH7.4+0.25M Sucrose+5mM MgSO4 + 1mM Na3VO4 + 1mM PMSF + g/ml aprotinin + 10g/ml leupeptin蛋白组学二维电泳(1)课件第二章 二维电泳与蛋白质分离n一、蛋白质的提取与样品制备一、蛋白质的提取与样品制备n二、二维等电聚焦二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳维等电聚焦电泳n三、胶上蛋白质检测技术三、胶上蛋白质检测技术蛋白组学二维电泳(1)课件电泳的概念电泳的概念n带电颗粒在一定的介质中，在电场的作用下，向着带电颗
46、粒在一定的介质中，在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。与其电性相反的电极移动的现象。n影响电泳速度的主要因素：影响电泳速度的主要因素：n电场强度（电场强度（E）：）：E越高，电泳速度越快越高，电泳速度越快n溶液的溶液的pH值：值：pI和和pH相差越多，带电越多，电泳速度越相差越多，带电越多，电泳速度越快快n溶液的离子强度（溶液的离子强度（I）：）：I越高，样品电流越小，电泳速度越高，样品电流越小，电泳速度越慢；越慢；I过低，可导致过低，可导致pH局部变化影响电泳速度局部变化影响电泳速度n电渗：电渗：介质局部电离导致的样品电泳速度改变介质局部电离导致的样品电泳速度改变n焦耳热（焦耳
47、热（Q）：）：热量高，促使溶液挥发；同时使得电流降热量高，促使溶液挥发；同时使得电流降低导致电泳速度减慢低导致电泳速度减慢蛋白组学二维电泳(1)课件生物实验室常用电泳生物实验室常用电泳n支持物分类支持物分类n滤纸及纤维膜等：玻璃纤维、醋酸纤维等滤纸及纤维膜等：玻璃纤维、醋酸纤维等n凝胶：凝胶：琼脂（琼脂（agarose）、聚丙烯酰胺凝胶（）、聚丙烯酰胺凝胶（PAG）等等n装置分类装置分类n平板式平板式n垂直板式垂直板式n圆盘式圆盘式npH连续性分类连续性分类n连续连续pHn非连续非连续pH：如等电聚焦电泳：如等电聚焦电泳蛋白组学二维电泳(1)课件聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polya
48、crylamide gel electrophoresis, PAGE）n聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（ polyacrylamide gel, PAG ）由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺（acrylamide，Acr）和和交交联联剂剂N，N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（ N，N-methylenebisacrylamide, Bis）聚合而成。）聚合而成。蛋白组学二维电泳(1)课件聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2) 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；化学
49、性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3) 对对pH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4) 几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；样品分离重复性好；(5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6) 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电
50、荷分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。的分辨率。蛋白组学二维电泳(1)课件二维电泳的基本原理二维电泳的基本原理n据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第），在第二方向按照分子量大小进行二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离分离（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
51、泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）n1st dimension: Isoelectric focusing (charge)n2nd dimension: SDS-PAGE (size)蛋白组学二维电泳(1)课件二维电泳结果二维电泳结果n二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天满天星星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对
52、丰度三方面的数据。相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。n传统的二维电泳最好条件下传统的二维电泳最好条件下20cm 20cm的胶理论的胶理论上可分辨上可分辨10,000个蛋白点（各个方向个蛋白点（各个方向100点），实际点），实际上只能上只能3000个点个点.n二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，事实上由二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，事实上由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到的是蛋白质的亚基。的是蛋白质的亚基。蛋白组学二维电泳(1)课件一维等电
53、聚焦（一维等电聚焦（IEF）n蛋白质等电点蛋白质等电点pI是由其内氨基酸组成决定的特是由其内氨基酸组成决定的特性物化常数。当介质性物化常数。当介质pH高于其等电位置时，蛋高于其等电位置时，蛋白质带负电，反之带正电；此时外加一个电场，白质带负电，反之带正电；此时外加一个电场，蛋白质分子就分别向正极或负极移动，当达到蛋白质分子就分别向正极或负极移动，当达到其等电点位置时，蛋白质不带电就不再漂移。其等电点位置时，蛋白质不带电就不再漂移。这样，蛋白质组内的蛋白质按照这样，蛋白质组内的蛋白质按照pI不同分布在不同分布在胶上不同位置，这就是等电聚焦基本原理。胶上不同位置，这就是等电聚焦基本原理。蛋白组学二
54、维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件等等电电聚聚焦焦电电泳泳：当当蛋蛋白白质质在在其其等等电电点点时时，净电荷为零，在电场中不再移动。净电荷为零，在电场中不再移动。+7.06.05.0稳定pH梯度7.06.05.0稳定pH梯度通电+蛋白组学二维电泳(1)课件等电聚焦电泳主要分为二种等电聚焦电泳主要分为二种n载载体体两两性性电电解解质质SCA （一一种种人人工工合合成成的的两两性性分分子子，Synthetic carrier ampholyte）：等等电电聚聚焦焦在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺管管胶胶(Tube gel)中中进进行行，载载体体两两性性电电解解质质 (Carrier Ampholy
55、tes)在在外外加加电电场场作作用用下下形形成成pH梯梯度度。 （分辨率：（分辨率：0.01 pH单位）单位）npH梯梯度度在在碱碱性性区区不不稳稳定定(阴阴极极漂漂移移)、重重复复性性不不易易掌掌握握、上上样样量量低低和一般不能分离等电点大于和一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质的碱性蛋白质n电电泳泳设设备备要要求求不不高高，电电泳泳溶溶液液容容易易配配制制，易易于于开开展展工工作作。优优化化各各种种电电泳泳条条件件，可可达达到到非非常常高高的的分分辨辨率率，目目前前唯唯一一分分辨辨到到10000个个蛋蛋白质，也可获得好的重复性白质，也可获得好的重复性 n固固相相pH梯梯度度：pH梯梯度
56、度的的形形成成依依赖赖于于不不同同pK值值的的Immobilines。 Immobilines是是丙丙烯烯酰酰胺胺的的衍衍生生物物，为为非非两两性性的的弱弱酸酸和和弱弱碱碱，在在凝凝胶胶聚聚合合过过程程中中，能能与与聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺共共价价结结合合。因因此此，IPG胶胶的的pH梯梯度度是是稳稳定定的的 (Immobilized pH gradients，IPG) ，不不依依赖赖于于外外加加电电场场，基基本本上上克克服服了了载载体体两两性性电电解解质质pH梯梯度度的的主主要要缺缺点点。 （分分辨辨率率：0.001 pH单位）单位）蛋白组学二维电泳(1)课件载体两性电解质的特性载体两性电解质的
57、特性n足够高的缓冲能力，足够高的缓冲能力，pH梯度不致被蛋白改变梯度不致被蛋白改变n在等电点有足够高的电导，有一定的电流通过在等电点有足够高的电导，有一定的电流通过n分子量小分子量小n化学性质稳定，惰性化学性质稳定，惰性蛋白组学二维电泳(1)课件载体两性电解质载体两性电解质pH梯度的形成梯度的形成n人工人工pH梯度法梯度法：利用两种不同：利用两种不同pH的缓冲液相互扩的缓冲液相互扩散，在混合区形成散，在混合区形成pH梯度梯度n天然天然pH梯度法梯度法：多种载体两性电解质在电场作用下：多种载体两性电解质在电场作用下自然形成自然形成pH梯度。常用。梯度。常用。n没有电场作用下，溶液没有电场作用下，
58、溶液pH是溶液是溶液pH范围的平均值范围的平均值n通电后，载体两性电解质向两极移动通电后，载体两性电解质向两极移动npI最小（带最多负电），向正极移动最快，在最小（带最多负电），向正极移动最快，在pHpI处停下来，处停下来，并最接近阳极并最接近阳极npI最大（带最多正电），向负极移动最快，在最大（带最多正电），向负极移动最快，在pHpI处停下来，处停下来，并最接近阴极并最接近阴极蛋白组学二维电泳(1)课件载体两性电解质分离蛋白质原理载体两性电解质分离蛋白质原理n通电后，载体两性电解质可在支持介质中形成通电后，载体两性电解质可在支持介质中形成线性线性pH梯度梯度n加入蛋白质样品，蛋白质即按照等电
59、聚焦的原加入蛋白质样品，蛋白质即按照等电聚焦的原理进行分离，蛋白质都位于与其等电点理进行分离，蛋白质都位于与其等电点pI相当相当的的pH位置上。位置上。蛋白组学二维电泳(1)课件载体两性电解质的缺点载体两性电解质的缺点n早期的凝胶介质用的是载体两性电解质早期的凝胶介质用的是载体两性电解质SCA （一种人（一种人工合成的两性分子，工合成的两性分子，Synthetic carrier ampholyte），在电场中它们形成连续的在电场中它们形成连续的pH梯度，且其有很高的缓冲梯度，且其有很高的缓冲能力。但存在许多缺点：能力。但存在许多缺点： A、SCA的合成方法太复杂，导致产品稳定性较差，的合成方
60、法太复杂，导致产品稳定性较差，实验重复性不好。实验重复性不好。 B、SCA分子量较小，在分子量较小，在IEF过程中由水合正离子引过程中由水合正离子引起的电渗流将使起的电渗流将使SCA向负极漂移，造成向负极漂移，造成pH不稳定。不稳定。 C、负极漂移造成的碱性区蛋白质难以成功聚焦，、负极漂移造成的碱性区蛋白质难以成功聚焦，导致碱性蛋白质丢失。导致碱性蛋白质丢失。蛋白组学二维电泳(1)课件固相固相pH梯度等电聚焦电泳梯度等电聚焦电泳nIPG（固相（固相pH梯度，梯度，Immobilized pH gradient）等电聚焦电泳（）等电聚焦电泳（IEF）是在）是在Immobilines试剂的基础上开
61、发的技术。试剂的基础上开发的技术。n利用一系列弱酸弱碱丙烯酰胺衍生物滴定时，利用一系列弱酸弱碱丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定点附近形成在滴定点附近形成pH梯度，然后共价结合在介梯度，然后共价结合在介质（丙烯酰胺）上，成为凝胶一部分，从而形质（丙烯酰胺）上，成为凝胶一部分，从而形成固定成固定pH梯度。梯度。n优点：分辨率高（优点：分辨率高（0.001 pH单位），重复性好，单位），重复性好，pH梯度稳定，上样量更高。梯度稳定，上样量更高。蛋白组学二维电泳(1)课件一维固相一维固相pH梯度等电凝胶梯度等电凝胶nIPG胶的材料是胶的材料是Immobilines，为拥有，为拥有CH2=CH-CO-NH-
62、R结构的多种丙烯酰胺衍生物系列，其中结构的多种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含包含羧基或叔氨基团。每种衍生物的羧基或叔氨基团。每种衍生物的pI值不同，不同比值不同，不同比例的混合物构成了分布在例的混合物构成了分布在pH310不同值的缓冲体不同值的缓冲体系。系。n根据配方计算后，将适宜的根据配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至丙烯酰胺骨架中而形成价聚合至丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。梯度。n通过这种方式生成的通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因不会发生电渗透作用，因而可以
63、进行特别稳定的而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状分离达到真正的平衡状态。态。蛋白组学二维电泳(1)课件IPG胶条的重泡涨胶条的重泡涨n商品化的胶条是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，商品化的胶条是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。 n泡涨的实质：让样品能完全以可溶的形式进入泡涨的实质：让样品能完全以可溶的形式进入IPG内，从而内，从而能进行接下来的能进行接下来的IEF电泳。电泳。n重泡涨液的成分为重泡涨液的成分为8 mol/L Urea, 2%CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG
64、 Buffer, Bromophenol Blue Trace，和裂解液，和裂解液基本相同基本相同 n窄窄pH范围的胶条，如范围的胶条，如pH9-12或或pH10-12 ，重泡涨液的成分，重泡涨液的成分要根据样品做适当修改要根据样品做适当修改n核糖体蛋白，重泡涨液的成分为核糖体蛋白，重泡涨液的成分为8 mol/L Urea, 10% v/v 2-propanol, 10% v/v Glycerol, 1% w/v CHAPS, 20 mmol/L DTT, 0.5% Pharmalyte 3-10, 0.2% w/v Methycellulose蛋白组学二维电泳(1)课件重泡涨中参数的选择重泡
65、涨中参数的选择n加样方法的选择（重泡涨上样、杯上样）加样方法的选择（重泡涨上样、杯上样）n重泡涨可以在等电聚焦盘内进行，此时样品加到重泡涨液中，重泡涨可以在等电聚焦盘内进行，此时样品加到重泡涨液中，在重泡涨过程中进入胶条在重泡涨过程中进入胶条n在加样杯上样在加样杯上样(cup-loading)方式中，胶条在专门的重泡涨盘内方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。 nDTT的使用：的使用：10 mmol/L到到100 mmol/L浓度范围内适当提高浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度 n重泡
66、涨时间至少要重泡涨时间至少要10小时，泡涨不充分会影响相对分子质量较高小时，泡涨不充分会影响相对分子质量较高的蛋白质的吸收的蛋白质的吸收 n重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，一般参照产品说明书重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，一般参照产品说明书n温度的选择：温度都稳定在温度的选择：温度都稳定在20，温度太低尿素会结晶出来，温，温度太低尿素会结晶出来，温度不稳定也会造成胶上蛋白质点位置的变化度不稳定也会造成胶上蛋白质点位置的变化 n电压的选择：重泡涨时加上电压的选择：重泡涨时加上30V或或50V的低压会促进胶条对蛋白质的低压会促进胶条对蛋白质的吸收的吸收蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白质加样方式蛋
67、白质加样方式n胶内重泡涨胶内重泡涨(In-gel Rehydration) ：样品在重泡涨时加入：样品在重泡涨时加入 。样品加到重。样品加到重泡涨液中，在重泡涨过程中进入胶条泡涨液中，在重泡涨过程中进入胶条n推荐的方式，可以增加蛋白质上样量，也避免了在阴极或阳极加样推荐的方式，可以增加蛋白质上样量，也避免了在阴极或阳极加样的方向问题的方向问题 n加样杯加样加样杯加样(Cup-Loading)：重泡涨完成后再转入等电聚焦盘内用专用的：重泡涨完成后再转入等电聚焦盘内用专用的加样杯加样加样杯加样n重泡后加样相对不十分可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和重泡后加样相对不十分可靠，操作比较困难而且蛋白
68、质容易在胶和样品的界面产生沉淀样品的界面产生沉淀 n某些特殊情况下，如使用某些特殊情况下，如使用pH6-11或或pH6-9的胶条分离碱性蛋白质时，的胶条分离碱性蛋白质时，在阳极用加样杯加样，可以得到更好的分离图谱在阳极用加样杯加样，可以得到更好的分离图谱 n纸桥加样纸桥加样(Paper Bridge Loading) ：胶条重泡涨好以后，用：胶条重泡涨好以后，用1.55.0 cm的的滤纸做为纸桥覆盖在胶条的一端，将样品加到滤纸上滤纸做为纸桥覆盖在胶条的一端，将样品加到滤纸上 n可显著提高蛋白质的上样量，并在分辨率和相对分子质量较高的蛋可显著提高蛋白质的上样量，并在分辨率和相对分子质量较高的蛋白
69、质的分离方面有所改善白质的分离方面有所改善蛋白组学二维电泳(1)课件水化上样水化上样n胶条面朝下覆盖在样品缓冲液上，电极位于胶面两端胶条面朝下覆盖在样品缓冲液上，电极位于胶面两端n可以主动水化、被动水化，选择灵活可以主动水化、被动水化，选择灵活n水化、上样同时进行水化、上样同时进行n操作简便，重复性好，适于分析型实验操作简便，重复性好，适于分析型实验n对极酸对极酸/极碱性蛋白聚焦效果不够好极碱性蛋白聚焦效果不够好蛋白组学二维电泳(1)课件杯上样杯上样n水化完成后使用加样杯在胶条上方上样水化完成后使用加样杯在胶条上方上样n电极间距可调，一个聚焦盘可放入不同长度的胶条电极间距可调，一个聚焦盘可放入
70、不同长度的胶条n对酸对酸/碱性蛋白分离效果较好碱性蛋白分离效果较好n上样量较大，适于制备型实验上样量较大，适于制备型实验n结果重复性不如水化上样结果重复性不如水化上样蛋白组学二维电泳(1)课件等电聚焦设备等电聚焦设备GE公司公司IPGphor 水平电泳系水平电泳系统统Bio-Rad公司的公司的Protean IEF System水平电泳系统水平电泳系统 蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件影响蛋白载样量的因素影响蛋白载样量的因素n影响影响IPG胶条蛋白载样量的因素包括：胶条蛋白载样量的因素包括：n待分析的蛋白点的量应满足后续的质谱分析待分析的蛋白点的量应满足后续的质谱分析n电泳
71、的目的：如果仅仅是为了得到一张好图，则电泳的目的：如果仅仅是为了得到一张好图，则无需考虑太多其它因素。无需考虑太多其它因素。n待研究蛋白的丰度待研究蛋白的丰度n样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能了解包含的蛋白，需要反复实验才能完成。如果了解包含的蛋白，需要反复实验才能完成。如果待测样品富集以后则更易分析待测样品富集以后则更易分析nIPG胶条的胶条的pH范围：范围：pH范围越窄，上样量越大范围越窄，上样量越大蛋白组学二维电泳(1)课件IPG胶条的上样量胶条的上样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver sta
72、ining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 l蛋白组学二维电泳(1)课件IPG IEF 中中pH梯度的选择梯度的选择n常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。先短后长，预试验确定。蛋白组学二维电泳(1)课件预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成
73、份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍蛋白组学二维电泳(1)课件聚焦时间的优化聚焦时间的优化n理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是佳时间是IEF分离达到稳定态
74、所需的时间。分离达到稳定态所需的时间。n聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。n过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。条纹以及蛋白丢失。n最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。范围和胶条长度通过经验来确定。蛋白组学二维电泳(1)
75、课件等电聚焦过程等电聚焦过程n等电聚焦的电压上升分为三个阶段：首先加上一个比较低的等电聚焦的电压上升分为三个阶段：首先加上一个比较低的电压，去除胶条中的过多的盐离子。然后开始加高压，电压电压，去除胶条中的过多的盐离子。然后开始加高压，电压上升的模式为缓慢上升。最后是持续高压，电压上升的模式上升的模式为缓慢上升。最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。为快速上升。n第一向等电聚焦仪第一向等电聚焦仪Protean IEF（ Bio-Rad ）最多可加到）最多可加到10000V的高的高压压 nIPGphor（GE Healthcare）的最高电压为）的最高电压为8000V n一般原则是，根据胶条的
76、一般原则是，根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电压范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定范围内调整。时间积可以在一定范围内调整。 n上样量大、上样量大、pH范围窄则总电压时间积高范围窄则总电压时间积高 nBio-Rad公司胶条总的电压时间积为公司胶条总的电压时间积为7cm 835 kVH, 11cm 1560 kVH, 17cm 25100 kVH蛋白组学二维电泳(1)课件等电聚焦条件等电聚焦条件Step 1Step 2Step 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 h
77、r14,000V-hr7cmStep 1Step 2Step 3totaltotalStep 1Step 2Step 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid蛋白组学二维电泳(1)课件Protean IEF的聚焦设置和结果的聚焦设置和结果pH 4 7蛋白组学二维电泳(1)课件两维间的平衡两维间的平衡n一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片一维结束后可马上
78、进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于塑料膜间于80保存数月。保存数月。n但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在完整结合，从而在SDS-PAGE时电泳能顺利进行。时电泳能顺利进行。蛋白组学二维电泳(1)课件平衡条件的选择平衡条件的选择n平衡液：用含平衡液：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和尿素和30%甘油的甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡）缓冲液先平衡15min，再用，再用5%(m/v)碘乙酰胺（碘乙酰胺（IAA）取代）取代DTT后的上述缓冲液平衡后的
79、上述缓冲液平衡15min。n尿素和甘油可增加溶液粘度，减少电内渗。电内渗作用是由固相化尿素和甘油可增加溶液粘度，减少电内渗。电内渗作用是由固相化的两性电解质造成的，它影响蛋白质从第一向到第二向的转移的两性电解质造成的，它影响蛋白质从第一向到第二向的转移nSDS用于变性蛋白质，使蛋白质带上负电荷，这对第二向用于变性蛋白质，使蛋白质带上负电荷，这对第二向SDS-PAGE来讲是十分重要的来讲是十分重要的 nDTT和和IAA分别用于打开和烷基化封闭蛋白质的二硫键分别用于打开和烷基化封闭蛋白质的二硫键 n溴酚蓝用来检测电泳过程溴酚蓝用来检测电泳过程 n两次平衡的时间均为两次平衡的时间均为15分钟，如果图
80、谱的竖直条纹较多平衡分钟，如果图谱的竖直条纹较多平衡时间可适当延长到时间可适当延长到20分钟，时间太短蛋白质没有被分钟，时间太短蛋白质没有被SDS充分充分包裹，容易产生水平条纹。包裹，容易产生水平条纹。蛋白组学二维电泳(1)课件第一向到第二向的转移第一向到第二向的转移n3T%的的IPG胶条可以看作为压缩胶，所以一般只使用分离胶，胶条可以看作为压缩胶，所以一般只使用分离胶，但也有人用压缩胶。但也有人用压缩胶。n IPG胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲液里浸润一下胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲液里浸润一下n可以清洗胶条，去除胶条上的平衡液可以清洗胶条，去除胶条上的平衡液n润湿的胶条容易沿着玻
81、璃板推到润湿的胶条容易沿着玻璃板推到SDS-PAGE凝胶上凝胶上n IPG胶条转移到胶条转移到SDS-PAGE胶有两种方式胶有两种方式n先将先将IPG胶条放到胶条放到SDS-PAGE胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液。图谱胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液。图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡产生。相比之下，气泡对不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡产生。相比之下，气泡对图谱的影响较小，故为推荐方式图谱的影响较小，故为推荐方式 n先加入熔化的琼脂糖溶液，再将先加入熔化的琼脂糖溶液，再将IPG胶条放到胶条放到SDS-PAGE胶上。非常胶上。非常好地解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入好地解决了
82、胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入IPG胶条时胶条时有时会造成图谱变形。有时会造成图谱变形。蛋白组学二维电泳(1)课件聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（poly-acrylamide gel,PAG）n聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（ polyacrylamide gel, PAG ）由由单单体体丙丙烯烯酰酰胺胺（acrylamide，Acr）和和交交联联剂剂N，N-甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺（ N，N-methylenebisacrylamide, Bis）聚合而成。聚合而成。蛋白组学二维电泳(1)课件根据不同的分离目的，按不同浓度比例来配制根据不同的分离目的，按不同浓度比例来配制PAG胶
83、胶:a、丙烯酰胺丙烯酰胺 CH2=CH-CO-NH2b、N,N-甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2T、2个单体的总百分浓度个单体的总百分浓度C、 N,N-甲叉丙烯酰胺占两个单体总质量的百分比甲叉丙烯酰胺占两个单体总质量的百分比m、凝胶聚合前的溶液体积、凝胶聚合前的溶液体积 T=(a+b)/m 100%, C=b/(a+b) 100%(1)T值一般在值一般在5%-30%之间，之间，T太大粘度增加，太大粘度增加，T太小凝胶脆太小凝胶脆性太大溶液破裂。预实验取性太大溶液破裂。预实验取13%,然后根据蛋白质分子量调整然后根据蛋白质分子量调整T值。值。(
84、2)C值一般在值一般在3%左右，而取左右，而取2.6%更易于分离。更易于分离。蛋白组学二维电泳(1)课件第二向分离：第二向分离：SDSPAGE原理原理nSDS-PAGE：十二烷基磺酸钠：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳nSDS：变性剂和助溶剂：变性剂和助溶剂nDTT， -巯基乙醇巯基乙醇：还原剂：还原剂nSDS是一种阴离子去垢剂，溶液中是一种阴离子去垢剂，溶液中SDS达一定达一定浓度浓度时，可以和蛋白质结合，使得蛋白质浓度浓度时，可以和蛋白质结合，使得蛋白质负电荷过剩，掩盖了蛋白质本身的电荷。负电荷过剩，掩盖了蛋白质本身的电荷。n蛋白质的形状与蛋白质的分子量成比例。蛋白质的
85、形状与蛋白质的分子量成比例。n在电场作用下，各个蛋白质的形状决定蛋白质在电场作用下，各个蛋白质的形状决定蛋白质的迁移率，也就实现了按照分子量大小进行分的迁移率，也就实现了按照分子量大小进行分离。离。n蛋白质的迁移率与分子量的对数有线性关系。蛋白质的迁移率与分子量的对数有线性关系。蛋白组学二维电泳(1)课件垂直电泳设备垂直电泳设备GE公司公司Hoefer SE垂直电垂直电泳系统泳系统 Bio-Rad公司公司PROTEAN II XL Cell垂直电泳系统垂直电泳系统 蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件二维二维SDS-PAGEn同普通同普通SDS-PAGE类似。类似。n但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。浓缩胶。蛋白组学二维电泳(1)课件2-DE (two dimensional electrophoresis)IEFSDS-PAGE蛋白组学二维电泳(1)课件蛋白组学二维电泳(1)课件
