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1、 植物叶片植物叶片DNADNA的提取的提取 DNA extraction实验一实验一植物叶片中DNA的提取课件实验原理实验原理利利用用基基因因组组DNA较较长长的的特特性性，可可以以将将其其与与细细胞胞器器或或质质粒粒等等小小分分子子DNA分分离离。加加入入一一定定量量的的异异丙丙醇醇或或乙乙醇醇，基基因因组组的的大大分分子子DNA即即沉沉淀淀形形成成纤纤维维状状絮絮团团飘飘浮浮其其中中, 可可用用玻玻棒棒将将其其取取出出，而而小小分分子子DNA则则只只形形成成颗颗粒粒状状沉沉淀淀附附于于壁壁上上及及底底部部, 从从而而达达到到提提取取的的目目的的。在在提提取取过过程程中中,染染色色体体会会发
2、发生生机机械械断断裂裂，产产生生大大小小不不同同的的片片段段，因因此此分分离离基基因因组组DNA时时应应尽尽量量在在温温和和的的条条件件下下操操作作，如如尽尽量量减减少少酚酚/氯氯仿仿抽抽提提、混混匀匀过过程程要要轻轻缓缓, 以以保保证证得得到到较较长长的的DNA。一一般般来来说说,构构建建基基因因组组文文库库, 初初始始DNA长长度度必必须须在在100kb以以上上,否否则则酶酶切切后后两两边边都都带带合合适适末末端端的的有有效效片片段段很很少少。而而进进行行RFLP和和PCR分分析析, DNA长长度度可可短短至至50kb，在在该该长长度度以以上上，可可保保证证酶酶切切后后产产生生RFLP片段
3、片段(20kb以下以下)，并可保证包含，并可保证包含PCR所扩增的片段所扩增的片段(一般一般2kb以下以下)。不不同同生生物物（植植物物、动动物物、微微生生物物）的的基基因因组组DNA的的提提取取方方法法有有所所不不同同; 不不同同种种类类或或同同一一种种类类的的不不同同组组织织因因其其细细胞胞结结构构及及所所含含的的成成分分不不同同，分分离离方方法法也也有有差差异异。在在提提取取某某种种特特殊殊组组织织的的DNA时时必必须须参参照照文文献献和和经经验验建建立立相相应应的的提提取取方方法法，以以获获得得可可用用的的DNA大大分分子子，尤尤其其是是组组织织中中的的多多糖糖和和酶酶类类物物质质对对
4、随随后后的的酶酶切切、PCR反反应应等等有有较较强强的的抑抑制制作作用用，因因此此用用富富含含这这类类物质的材料提取基因组物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。时，应考虑除去多糖和酚类物质。 植物叶片中DNA的提取课件实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：植物幼嫩叶子。实验材料：植物幼嫩叶子。实验所需试剂：实验所需试剂：1. 提取缓冲液提取缓冲液：100 mmol/L TrisCl (pH8.0), 20mmol/L 2. EDTA, 500 mmol/L NaCl, 1.5% SDS3.2. 80:4:16/氯仿氯仿:戊醇戊醇:乙醇乙醇 4.3. RnaseA母液母液 4.
5、 其它试剂：液氮、异丙醇、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、缓冲液，无水乙醇、70%5. 乙醇、乙醇、3mol/L NaAc。植物叶片中DNA的提取课件实验仪器实验仪器植物叶片中DNA的提取课件离心机植物叶片中DNA的提取课件各种型号的微量移液枪各种型号的微量移液枪植物叶片中DNA的提取课件研钵研钵不同型号的不同型号的eppendorf管管植物叶片中DNA的提取课件实验实验步骤步骤：1.水稻幼苗或叶水稻幼苗或叶片片0.1-0.2g, 剪碎剪碎, 置研钵中，加入置研钵中，加入1mL提取缓冲液，提取缓冲液，2. 研磨成浆；研磨成浆；2. 吸入吸入1.5mL EP管中，剧烈摇动混匀；管中
6、，剧烈摇动混匀；3. 60水浴保温水浴保温30-60min，不时不时颠倒混匀；颠倒混匀； 4. 室温下室温下10000rpm离心离心5min；5. 小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动；小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动；6. 室温下室温下10000rpm离心离心5min； 7. 小心小心将将上清吸入新的离心管中；上清吸入新的离心管中； 8. 加入加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。沉淀。 9.8000rpm离心离心5min ，弃掉上清；，弃掉上清；10.75酒精洗一次，酒精洗一次，晾干沉淀；晾干沉淀；10
7、. 加入加入5L RNaseA（10g/L）, 37 10min, 除去除去RNA。11. 加加50-100l水融解水融解，-20贮存。贮存。 植物叶片中DNA的提取课件1. 植物叶子植物叶子0.1- 0.2g, 剪碎置预冷研钵中剪碎置预冷研钵中 加入加入1mL提取缓冲提取缓冲液，研磨成浆液，研磨成浆 植物叶片中DNA的提取课件2. 吸入吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀管中，摇动混匀 植物叶片中DNA的提取课件3. 3. 60水浴保温水浴保温30-60min植物叶片中DNA的提取课件4. 10000rpm离心离心5min植物叶片中DNA的提取课件5. 吸上清于新的离心管中，加入
8、等体积氯仿，颠倒混匀吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀植物叶片中DNA的提取课件6. 6. 再次再次10000rpm离心离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；将上清小心吸入新的离心管中； 植物叶片中DNA的提取课件7. 加加入入1倍倍体体积积异异丙丙醇醇，-20 放放置置10min，出出现现絮絮状状DNA沉沉淀；淀； 随随后后8000rpm离离心心5min ，弃弃掉掉上上清清；75酒酒精精洗洗沉沉淀淀一一次次晾晾干干沉沉淀淀；加加5L RNaseA (10g/L), 37 10min, 除除去去RNA； 加加50-100L的的TE Buffer ，取取1-5L电电泳泳检检测测
9、；其其余余-20 贮存备用。贮存备用。植物叶片中DNA的提取课件DNA样品在样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图）胶上电泳（例图） 植物叶片中DNA的提取课件实验注意事项实验注意事项1.微微量量移移液液枪枪的的使使用用一一定定要要规规范范，吸吸取取氯氯仿仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；2.提提取取过过程程中中的的机机械械力力可可能能使使大大分分子子DNA断断裂裂成成小小片片段段，所所以以为为保保证证DNA的的完完整整性性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。植物叶片中DNA的提取课件思考题思考题: 1.为什么构建为什么构建DNA文库时文库时, 一定要用大分一定要用大分 子子DNA？ 2. 如何检测和保证如何检测和保证DNA的质量？的质量？植物叶片中DNA的提取课件
