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1、n n（5 5） (embeding)(embeding)：n n目目的的: :包包埋埋的的目目的的是是让让包包埋埋剂剂完完全全浸浸透透到到组组织织内内部部，经经加加温温逐逐渐渐聚聚合合成成坚坚硬硬的的固固体体，成成为为细细胞胞结结构构的的支支架架，能能够够承承受受切切片片的的各各种种力力的的作作用用，有利于切薄片。有利于切薄片。n n包包埋埋剂剂的的性性质质: :粘粘度度适适中中，有有良良好好的的切切割割性性能能。能能耐耐受受电电子子束束的的轰轰击击，高高温温不不易易升升华华、不变形。不变形。透明度好。透明度好。对人无害。对人无害。电镜超薄切包埋剂的种类n n环氧树脂类：环氧树脂类：n n目
2、前国内使用较多的环氧树脂有进口的目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon812和国产的和国产的618。电镜超薄切n n原理原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，
3、在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。交链状聚合物。电镜超薄切n n这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。困难，而且反差较弱。电镜超薄切低粘度包埋剂(Spurr)n n为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树
4、脂，能较好地渗入组织内部，对组织结的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。电镜超薄切水溶性包埋剂：n n是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。n n原理原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。酶活性定
5、位和定量研究十分优良的包埋剂。n n包埋剂包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂、乙二醇甲基丙烯酸脂(简简称称GMA)、聚乙二醇、聚乙二醇、Aquon等等电镜超薄切n n所所 加加 的的 固固 化化 剂剂 ， 有有 十十 二二 烯烯 基基 虎虎 铂铂 酸酸 酐酐（DDSADDSA）和和甲甲基基内内次次甲甲基基四四氢氢苯苯二二甲甲酸酸酐酐（MNAMNA）, ,增增韧韧剂剂为为邻邻苯苯二二甲甲酸酸二二丁丁酯酯（DBPDBP）, ,加速剂为加速剂为2,4,6,2,4,6,一三苯酚（一三苯酚（DMP30DMP30）。）。电镜超薄切n n1 1环氧树脂的性能和配制：环氧树脂的性能和配制：n n61
6、8618618618树脂树脂树脂树脂 5ml 5ml 5ml 5mln n十二烯基丁二酸酐十二烯基丁二酸酐十二烯基丁二酸酐十二烯基丁二酸酐 DSADSADSADSA（固化剂）固化剂）固化剂）固化剂） 5 5 5 5mlmlmlmln n苯二甲酸二丁酯苯二甲酸二丁酯苯二甲酸二丁酯苯二甲酸二丁酯 DBPDBPDBPDBP（增塑剂）增塑剂）增塑剂）增塑剂） 0.3 0.3 0.3 0.3mlmlmlmln n2,4.62,4.62,4.62,4.6三苯酚三苯酚三苯酚三苯酚 称称称称DMP30DMP30DMP30DMP30（加速剂）加速剂）加速剂）加速剂） 0.1 0.1 0.1 0.1mlmlmlm
7、ln n 60 60 60 60o o o oC C C C烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌分搅拌分搅拌分搅拌10101010分钟，至分钟，至分钟，至分钟，至37373737o o o oC C C C温箱中使气泡温箱中使气泡温箱中使气泡温箱中使气泡
8、逸出。逸出。 电镜超薄切n nEpon812的配制n nA液： Epon812 62mln n DDSA(固化剂) 100mln nB液： Epon812 100mln n MNA(固化剂) 89mln n n n A液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。电镜超薄切n n1 1 1 1） 包埋的方法包埋的方法包埋的方法包埋的方法电镜超薄切n n常规包埋常规包埋常规包埋常规包埋n n将将将将浸浸浸浸透透透透在在在在包包包包埋埋埋埋剂剂剂剂的的的的组组组组织织织织块块块块，转转转转移
9、移移移到到到到包包包包埋埋埋埋囊囊囊囊中中中中，使使使使之位于囊的中央，然后加包埋剂。之位于囊的中央，然后加包埋剂。之位于囊的中央，然后加包埋剂。之位于囊的中央，然后加包埋剂。n n把把把把写写写写好好好好标标标标本本本本块块块块编编编编号号号号的的的的小小小小纸纸纸纸条条条条卷卷卷卷成成成成环环环环状状状状，放放放放入入入入囊囊囊囊中中中中，插入包埋剂中。插入包埋剂中。插入包埋剂中。插入包埋剂中。n n不加盖，不加盖，不加盖，不加盖，37373737o o o oC C C C过夜，这也就是纯包埋剂浸透。过夜，这也就是纯包埋剂浸透。过夜，这也就是纯包埋剂浸透。过夜，这也就是纯包埋剂浸透。n
10、n次日，升温到次日，升温到次日，升温到次日，升温到60606060o o o oC48C48C48C48小时固化。小时固化。小时固化。小时固化。n n固化完毕，关温箱，自然冷却。固化完毕，关温箱，自然冷却。固化完毕，关温箱，自然冷却。固化完毕，关温箱，自然冷却。n n去掉外壳，取出组织包埋块去掉外壳，取出组织包埋块去掉外壳，取出组织包埋块去掉外壳，取出组织包埋块n n将组织包埋块，存放在干燥器中。将组织包埋块，存放在干燥器中。将组织包埋块，存放在干燥器中。将组织包埋块，存放在干燥器中。 电镜超薄切n n定向包埋：定向包埋：n n注意事项注意事项n n防潮、干燥。包埋剂要充分混匀。防气泡。包埋后
11、立即清洗器皿。自身保护。干燥器中存放包埋块。电镜超薄切思考题n n1、试说明显示酸性磷酸酶有几种方法？、试说明显示酸性磷酸酶有几种方法？n n2、试设计在超微结构水平显示周期抑制蛋、试设计在超微结构水平显示周期抑制蛋白白P53的实验方法和步骤。的实验方法和步骤。电镜超薄切n n（6）切片n n1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3mm，目数为200-300电镜超薄切n n2 2）支持膜的制备：支持膜的制备：n n福福尔尔莫莫瓦瓦膜膜：常常用用氯氯仿仿配配制制的的 0.2%-1.5%0.2%-1.5%的的聚聚乙乙烯烯醇醇缩缩甲甲醛醛
12、液液（formrarformrar）。注注：制制膜膜时时室室内内的的温温度度小小于于60%60%，否否则则会会出出现白点。现白点。n n火火棉棉胶胶膜膜：特特点点，火火棉棉胶胶膜膜的的机机械械强强度度比比福福尔尔莫莫瓦瓦膜膜弱弱，但但制制作作容容易易。常常用用1-2%1-2%醋醋酸酸异异戊戊酯酯溶溶液液采采用用漏漏斗斗法法和和贴贴附附法法制制膜。膜。n n帕帕罗罗丁丁支支持持膜膜：目目前前国国外外比比较较常常用用，一一般般配配制制30%30%左左右右的的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。n n碳碳膜膜：炭炭膜膜的的机机械械程程度度和和稳稳定定性性较
13、较好好，适适用用于于高高分分辨辨率率的的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。n n复合膜：有机膜上喷镀复合膜：有机膜上喷镀5-105-10nmnm的碳膜。的碳膜。n n微孔支持膜：高分辨率观察使用。微孔支持膜：高分辨率观察使用。电镜超薄切n n2）包埋块修整：修成四面锥体（45oC角）电镜超薄切n n5）超薄切片机的构造n n6）切片操作n n7）切片厚度:n n 灰色 40-50nmn n 银灰色 50-70nmn n 金黄色 70-90nmn n 紫色 90nm以上电镜超薄切n n(7)(7)染色染色n n1 1） 常用的电子染色剂常用的电子染色
14、剂n n醋酸铀醋酸铀醋酸铀醋酸铀( ( ( (UOUOUOUO2 2 2 2(CH(CH(CH(CH3 3 3 3COO)COO)COO)COO)2 2 2 2.2H.2H.2H.2H2 2 2 2O OO O：n n特特性性：具具有有放放射射性性和和毒毒性性，对对光光不不稳稳定定，储储存存、染染色色最好闭光，变混则失效。最好闭光，变混则失效。n n广广泛泛使使用用，能能产产生生较较高高的的反反差差。主主要要是是提提高高核核酸酸、核核蛋蛋白白和和结结缔缔组组织织纤纤维维成成分分的的反反差差；对对糖糖分分、分分泌泌颗颗粒粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。溶酶体等也能染色，但对膜的结构染
15、色较差。n n常常用用浓浓度度：50%-70%50%-70%的的乙乙醇醇或或丙丙酮酮配配制制的的2%-3%2%-3%的的溶溶液。液。n n染的时间：组织块染色时间为染的时间：组织块染色时间为1-21-2h h或过夜。片染或过夜。片染3030minmin即可。即可。 电镜超薄切n n枸橼酸铅（枸橼酸铅（枸橼酸铅（枸橼酸铅（lead acetatelead acetatelead acetatelead acetate）：）：）：）：n n特特特特点点点点：毒毒毒毒性性性性大大大大。与与与与空空空空气气气气中中中中的的的的二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳结结结结合合合合形形形形成成成成白白白白色色
16、色色的碳酸铅沉淀。的碳酸铅沉淀。的碳酸铅沉淀。的碳酸铅沉淀。高高高高PHPHPHPH（11-1211-1211-1211-12）染色效果好。染色效果好。染色效果好。染色效果好。n n也也也也是是是是目目目目前前前前最最最最广广广广泛泛泛泛使使使使用用用用的的的的染染染染色色色色液液液液。它它它它具具具具有有有有很很很很高高高高的的的的电电电电子子子子密密密密度度度度，对对对对细细细细胞胞胞胞超超超超微微微微结结结结构构构构均均均均有有有有广广广广泛泛泛泛的的的的亲亲亲亲和和和和性性性性，能能能能提提提提高高高高细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜系系系系统统统统及酯类的反差。及酯类的反差。及酯类的反差。及
17、酯类的反差。n n枸橼酸铅（枸橼酸铅（枸橼酸铅（枸橼酸铅（lead citratelead citratelead citratelead citrate）溶液的配制溶液的配制溶液的配制溶液的配制n n硝酸铅硝酸铅硝酸铅硝酸铅Pb(NOPb(NOPb(NOPb(NO3 3 3 3)2)2)2)2 1.33g 1.33g 1.33g 1.33gn n枸橼酸钠枸橼酸钠枸橼酸钠枸橼酸钠NaNaNaNa3 3 3 3(C6H(C6H(C6H(C6H6 6 6 6O OO O7 7 7 7).2H).2H).2H).2H2 2 2 2O OO O 1.76g 1.76g 1.76g 1.76gn n双蒸
18、水双蒸水双蒸水双蒸水 30 30 30 30mlmlmlmln n混混混混合合合合后后后后振振振振荡荡荡荡30303030minminminmin呈呈呈呈乳乳乳乳白白白白色色色色，加加加加1.01.01.01.0mol/Lmol/Lmol/Lmol/L新新新新鲜鲜鲜鲜配配配配制制制制的的的的NaOH8mlNaOH8mlNaOH8mlNaOH8mln n双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水 加至加至加至加至50505050ml ml ml ml 调调调调PHPHPHPH到到到到12 12 12 12 电镜超薄切n n2 2）染色方法染色方法n nA A、手工染色手工染色n n单单染染色色：用用一一种种染染色
19、色液液；一一般般材材料料铅铅染染好好，免免疫疫组化铀染好。组化铀染好。n n双染色：先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色。双染色：先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色。n n块块染染色色：锇锇酸酸固固定定后后，脱脱水水前前用用50%-70%50%-70%的的乙乙醇醇醋醋酸酸铀铀染染液液染染色色20-3020-30minmin，也也可可在在脱脱水水过过程程中中放放入入含含1%-2%1%-2%的的醋醋酸酸双双氧氧铀铀的的70%70%乙乙醇醇染染液液染染2-102-10h h（4 4o oC C冰冰箱）这样可以省去切片后的铀染过程。箱）这样可以省去切片后的铀染过程。n nB B自自动动染染色色：自自动动染染
20、色色使使用用事事先先制制好好的的，已已商商品品化化的的醋醋酸铀和柠檬酸铅，在自动染色仪内进行电镜常规染色。酸铀和柠檬酸铅，在自动染色仪内进行电镜常规染色。电镜超薄切电镜超薄切电镜超薄切 2、半薄切片的制备 3、几种特殊样品的制备（1）甲醛固定石蜡样品：脱蜡复水，锇酸固定，以下步骤同。（2）培养细胞及游离细胞：（3）血细胞制品（4）骨组织：骨组织固定液固定，脱钙，以下步骤同。微波快速制样：全部和部分微波处理45小时完成。电镜超薄切 4负染色技术1）定义：负染色技术是利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来的一种技术。2)应用：常用于病毒蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究。电镜超薄切n n负
21、染色样品的制备负染色样品的制备负染色样品的制备负染色样品的制备n n悬悬浮浮样样品品常常用用的的制制备备方方法法有有直直接接取取材材法法、样样品品提提纯纯法法、细细胞胞培培养养取取材材法法、抗抗体体- -病病毒毒凝凝集集法法、冷冷冻冻超超薄薄切片负染色法等切片负染色法等n n（1 1）直接取样法）直接取样法n n对对于于某某些些皮皮肤肤病病毒毒性性疱疱疹疹( (如如天天花花、水水痘痘及及疱疱疹疹等等) )可可用用毛毛细细吸吸管管直直接接刺刺人人疱疱疹疹中中取取样样，再再将将吸吸管管中中的的泡泡液液滴滴在在带带有有支支持持膜膜的的铜铜网网上上，待待稍稍干干后后立立即即染染色色观察。此法主要用于临
22、床快速诊断。观察。此法主要用于临床快速诊断。n n对对于于生生长长在在固固体体培培养养基基上上的的微微生生物物，可可用用白白金金环环刮刮取取，再再用用缓缓冲冲生生理理盐盐水水稀稀释释成成悬悬液液，即即可可滴滴样样，待待稍稍干干后后染染色色观观察察。对对于于生生长长在在琼琼脂脂板板上上的的噬噬菌菌体体斑斑，也可采用直接取样法。也可采用直接取样法。电镜超薄切n n（2 2）离心提纯法）离心提纯法n n用用于于细细菌菌、病病毒毒、噬噬菌菌体体等等微微生生物物或或细细胞胞匀匀浆浆中中线线粒粒体体、微微管管等等细细胞胞器器的的提提纯纯。先先用用低低速速离离心心(3000(3000转转/ /分分) )，弃
23、弃去去较较大大杂杂质质和和细细胞胞碎碎片片，再再用用适适当当孔孔径径的的滤滤膜膜过过滤滤，其其滤滤液液再再经经低低温温超超速速离离心心，最最后后取取沉沉淀淀物制成悬液滴样染色。物制成悬液滴样染色。n n（3 3）细胞培养取材法）细胞培养取材法n n从从培培养养瓶瓶中中刮刮下下所所培培养养的的腺腺病病毒毒或或疱疱疹疹病病毒毒，低低速速离离心心，弃弃上上清清液液，于于沉沉淀淀物物中中加加入入培培养养液液与与蒸蒸馏馏水水的的混混合合液液( (比比例例为为1 1：4)4)，使使细细胞胞因因低低渗渗破破裂裂而而释释放放出出病病毒毒，然然后后快快速速冻冻融融数数次次，再再将将冻冻融融后后的的悬悬液液低低速
24、离心，取其上清液滴膜染色速离心，取其上清液滴膜染色。电镜超薄切n n（4 4）抗体）抗体- -病毒凝集法病毒凝集法n n某某些些病病毒毒如如鼻鼻病病毒毒、风风疹疹病病毒毒、小小儿儿腹腹泻泻轮轮状状病病毒毒及及甲甲、乙乙型型肝肝炎炎抗抗原原等等，可可与与相相应应的的抗抗体体形形成成病病毒毒- -抗抗体体复复合合物物，经经离离心心沉沉淀淀而而浓浓缩缩，而而后后取取浓浓缩缩的的沉沉淀淀物物滴滴膜膜染染色色，可可找找到到较较多多的的病病毒毒。目目前前这这一一技技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。n n几种具体应用几种具体应用n n 细细菌菌培培养养物物：可可用用白白金金丝
25、丝接接菌菌环环在在斜斜面面培培养养基基上上刮刮取取少少许许菌菌苔苔于于双双蒸蒸水水中中配配成成悬悬液液。若若观观察察鞭鞭毛毛，则则用用不不超超过过2424小小时时培培养养的的新新菌菌落落，直直接接在在培培养养物物中中加双蒸水，细菌自动游动悬浮起来便可以观察。加双蒸水，细菌自动游动悬浮起来便可以观察。n n血血清清：血血清清需需要要等等量量的的蒸蒸馏馏水水稀稀释释，1500015000rpgrpg离离心心除除去去上上清清中中低低分分子子蛋蛋白白，将将沉沉淀淀用用蒸蒸馏馏水水悬悬浮浮即即可。可。电镜超薄切n n 粪粪便便：用用蒸蒸馏馏水水制制成成10%10%的的悬悬液液，30003000rpgrp
26、g离离心心15-3015-30分分钟钟，取取上上清清1500015000rpgrpg离离心心6060分分钟钟，稀稀释释沉淀剂可负染。沉淀剂可负染。n n尿尿液液：取取尿尿液液5-105-10mlml，3000rpg3000rpg离离心心15-3015-30分分钟钟，取取上上清清1500015000rpgrpg离离心心6060分分钟钟，稀稀释释沉沉淀淀剂剂可可负染。若病毒量少，可取大量的尿液。负染。若病毒量少，可取大量的尿液。n n 病病毒毒性性疱疱疹疹：最最好好选选用用未未破破裂裂的的疱疱疹疹，用用拉拉细细的的毛毛细细管管直直接接插插入入泡泡中中，吸吸取取泡泡液液，直直接接滴滴在在载载网网上负
27、染。上负染。n n脑脊髓液：取病人脑脊液少许，用双蒸水等量稀脑脊髓液：取病人脑脊液少许，用双蒸水等量稀释后直接进行负染。释后直接进行负染。 电镜超薄切n n痰液：可用磷酸盐缓冲液进行1：4稀释，并用均浆器均浆，经3000rpg离心5-10分钟，再用15000rpg离心60分钟，取沉淀稀释后负染。n n 活组织：取病组织加缓冲液均浆，经3000rpg离心5-10分钟，再用15000rpg离心60分钟，取沉淀稀释后负染。n n组织刮取物：痂皮或结合膜细胞数量较少，加少许蒸馏水是细胞膜破裂，即可负染。电镜超薄切n n（5 5 5 5） 常用的负染色剂：常用的负染色剂：n n 是是磷磷钨钨酸酸（pho
28、sphotungstic phosphotungstic acid acid ,PTA,PTA）、磷磷钨钨酸酸钾钾（KPTKPT）、磷磷钨钨酸酸钠钠（NaPTNaPT）。这这是是经经常常使使用用的的几几种种负负染染色色剂剂，适适用用于于多多数数直直接接取取样样的的样样品品和和纯纯化化样样品品，颗颗粒粒细细腻腻、反反差差良良好好、图图像像背背景景干干净净杂杂质质少少。一一般般配配制制成成1-3%1-3%的的水水溶溶液液，PHPH值值6.0-7.06.0-7.0使使用用。缺缺点点是是显显示示样样品品细细节节较较差差，对对某某些些病病毒毒有有破破坏坏作用。作用。n n 醋醋酸酸铀铀 是是一一种种常常
29、用用的的优优良良负负染染色色剂剂，能能较较好好地地显显示示病病毒毒颗颗粒粒的的细细节节，反反差差较较强强、对对样样品品破破坏坏小小。一般用一般用0.2-0.5%0.2-0.5%的水溶液，的水溶液，PHPH值值4.5-5.54.5-5.5左右。左右。电镜超薄切n n甲酸铀特别是用于螺旋对称的病毒颗粒。一般配制成0.5-1%的水溶液，临用前配制并调pH至5.5。n n 钼酸铵配制成2%3水溶液，使用时用醋酸铵将pH调至7.07.4之间。n n注：负染色液的PH值对负染的效果影响较大，一般偏酸的染液会得较好的效果，越是偏碱效果越差，碱性染液往往造成标本的凝聚变形。通常用的钨酸盐的PH值为6.0-7.
30、0，比较获得较好的效果。电镜超薄切n n（6 6 6 6） 负染色的操作方法负染色的操作方法n n滴染法：滴染法：n n漂浮法：漂浮法：n n喷雾法喷雾法n n应注意的问题：应注意的问题：负染的时机问题。负染的时机问题。提纯的病毒提纯的病毒最好最好1:10-1:1001:10-1:100稀释。悬浮病毒的缓冲液也尽可能地稀释。悬浮病毒的缓冲液也尽可能地稀释一些。稀释一些。负染用的支持膜疏水性的处理。（用负染用的支持膜疏水性的处理。（用离子溅射仪处理）。离子溅射仪处理）。负染中常遇到颗粒悬浮样品负染中常遇到颗粒悬浮样品的凝聚现象。办法可以通过的凝聚现象。办法可以通过2000-50002000-50
31、00rpgrpg离心和调离心和调节悬浮节悬浮PHPH值到中性和偏酸性来解决。值到中性和偏酸性来解决。 电镜超薄切n n五、电镜冷冻制备技术五、电镜冷冻制备技术n n应应用用：在在细细胞胞化化学学、免免疫疫电电镜镜、X X射射线线微微区区分分析析以以及及可可溶溶性性物物质质的的放放射射自自显显影影研研究究等等方方面，均得到了比较广泛的应用。面，均得到了比较广泛的应用。n n（一一）过过程程。这一过程受样品含水量和水分存在的形式，冷冻速度、冷冻温度、细胞冷冻点和再结晶点的温差等因素的影响。电镜超薄切n n（二）（二）（二）（二） 问题问题问题问题n n1 1 1 1、冰冻过程中冰晶形成及其后果。冰
32、冻过程中冰晶形成及其后果。冰冻过程中冰晶形成及其后果。冰冻过程中冰晶形成及其后果。n n 冷冷冷冷冻冻冻冻的的的的速速速速度度度度决决决决定定定定了了了了冰冰冰冰晶晶晶晶的的的的大大大大小小小小。300300300300o o o oCV/CV/CV/CV/秒秒秒秒冰冰冰冰晶晶晶晶颗颗颗颗粒粒粒粒为为为为100100100100nmnmnmnm，500/500/500/500/秒秒秒秒为为为为50505050nmnmnmnm，800800800800o o o oC/C/C/C/秒秒秒秒为为为为30303030nmnmnmnm，最好最好最好最好101010104 4 4 4o o o oCV/
33、CV/CV/CV/秒秒秒秒n n 冷冻温度因素决定了冰晶的形态。冷冻温度因素决定了冰晶的形态。冷冻温度因素决定了冰晶的形态。冷冻温度因素决定了冰晶的形态。n n 细细细细胞胞胞胞冷冷冷冷冻冻冻冻点点点点与与与与再再再再结结结结晶晶晶晶点点点点温温温温差差差差的的的的关关关关系系系系，控控控控制制制制着着着着冰冰冰冰晶晶晶晶的成长。的成长。的成长。的成长。n n 冷冷冷冷冻冻冻冻固固固固定定定定的的的的优优优优点点点点：避避避避免免免免化化化化学学学学反反反反应应应应；避避避避免免免免细细细细胞胞胞胞变变变变形形形形；减少组织自溶的机会；电镜免疫鉴定。减少组织自溶的机会；电镜免疫鉴定。减少组织自
34、溶的机会；电镜免疫鉴定。减少组织自溶的机会；电镜免疫鉴定。电镜超薄切n n2 2、措施、措施 n n1 1）选择合适的制冷剂，选择合适的制冷剂，n n特殊装置的使用特殊装置的使用n n2 2）防冷冻剂使用防冷冻剂使用n n醛类固定醛类固定n n5%-30%5%-30%的甘油冷冻保护的甘油冷冻保护n n明胶甲基纤维素或牛血清蛋白分子包埋明胶甲基纤维素或牛血清蛋白分子包埋电镜超薄切n n（四）冷冻制片过程（四）冷冻制片过程n n1 1、冰冻超薄切片、冰冻超薄切片 在低温下进行超薄切片在低温下进行超薄切片. .n n1)1)非非固固定定样样品品的的制制备备 取取材材后后快快速速冷冷冻冻和和切切片处理
35、。片处理。n n优优点点：有有利利于于保保存存生生物物材材料料中中的的可可溶溶性性物物质质以以及及生生物物大大分分子子的的活活性性和和天天然然构构型型。此此法法适适用用于于可可溶溶性性物物质质的的放放射射自自显显影影和和X X线线显显微微分分析研究。析研究。n n缺点缺点: :是不能得到很好的超微结构图像。是不能得到很好的超微结构图像。电镜超薄切n n2)2)2)2) 固固固固定定定定样样样样品品品品制制制制备备备备法法法法 取取取取材材材材后后后后用用用用0.10.10.10.1MMMM的的的的二二二二甲甲甲甲昆昆昆昆酸酸酸酸钠钠钠钠 （ CH3CH3CH3CH3） 2AsO.OnaSodi
36、um 2AsO.OnaSodium 2AsO.OnaSodium 2AsO.OnaSodium cacodylatecacodylatecacodylatecacodylate缓缓缓缓 冲冲冲冲 的的的的 、2.5%2.5%2.5%2.5%戊戊戊戊二二二二醛醛醛醛溶溶溶溶液液液液固固固固定定定定一一一一个个个个小小小小时时时时，以以以以保保保保存存存存大大大大分分分分子子子子的的的的结结结结构构构构和和和和生生生生物物物物活活活活性性性性，然然然然后后后后进进进进行行行行冷冷冷冷冻冻冻冻保保保保护护护护处处处处理理理理。这这这这种种种种方方方方法法法法作作作作出出出出的的的的标标标标本本本本适
37、适适适用用用用于于于于形形形形态态态态学学学学、细细细细胞胞胞胞化化化化学学学学和和和和免免免免疫疫疫疫化化化化学学学学的的的的研研研研究究究究。其步骤大致如下其步骤大致如下其步骤大致如下其步骤大致如下n n 戊戊戊戊二二二二醛醛醛醛固固固固定定定定后后后后，用用用用明明明明胶胶胶胶甲甲甲甲基基基基纤纤纤纤维维维维素素素素或或或或牛牛牛牛血血血血清清清清蛋蛋蛋蛋白白白白包埋组织块，以便切出大面积平整的切片。包埋组织块，以便切出大面积平整的切片。包埋组织块，以便切出大面积平整的切片。包埋组织块，以便切出大面积平整的切片。n n 在在在在冷冷冷冷冻冻冻冻之之之之前前前前将将将将标标标标本本本本浸浸
38、浸浸入入入入20%-30%20%-30%20%-30%20%-30%的的的的甘甘甘甘油油油油溶溶溶溶液液液液中中中中进进进进行冷冻保护处理。行冷冻保护处理。行冷冻保护处理。行冷冻保护处理。n n将样品放置在样品架上，投入液氮中快速冷冻。将样品放置在样品架上，投入液氮中快速冷冻。将样品放置在样品架上，投入液氮中快速冷冻。将样品放置在样品架上，投入液氮中快速冷冻。 电镜超薄切n n切切片片之之前前要要修修快快。修修快快可可用用切切片片机机修修，也也可可在在液液氮氮中中用用以以长长柄柄刀刀修修快快，但但最最好好在在固固定定过程中就修成梯形。过程中就修成梯形。n n冷冷度度超超薄薄切切片片的的程程序序和和常常规规超超薄薄切切片片相相似似，但但需需要要特特殊殊的的装装置置，切切速速要要慢慢。在在冷冷冻冻超超薄薄切切片片的的刀刀槽槽中中，盛盛有有二二甲甲基基亚亚砜砜在在低低温温下下不不冻结的液体。冻结的液体。n n 冷冷冻冻切切片片大大多多采采用用负负染染法法。此此方方法法简简单单、快速有利于保存结构等优点。快速有利于保存结构等优点。电镜超薄切
