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1、精品文档 精品文档 实验 4 细胞骨架的显示及观察 姓名：李思露 学号：131140040 一、 实验目的 1. 掌握用考马斯亮蓝 R250 染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。 2. 了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。 二、 实验原理 1. 细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule，MT） 、微丝（microfilament，MF） 、中间纤维（intermediated filament，IF） 。 2. 微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约 202
2、6nm 的长度不一的小管。分布在核周围， 呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细 胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋 白有和 两种。 异二聚体沿纵向聚 合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管 不稳定，对低温（冷冻） 、高压等物理因素及 秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫 杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解 聚。 3. 微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组 成的直径为 57nm 的骨架纤丝。主要分布在细胞 质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞 运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白 分为、和三种类型，不同种类细胞中肌动蛋 白组成不同。肌动蛋白单体为球形
3、，依次连接成链， 两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松 弛素 B 为微丝断裂剂。 4. 中间纤维：直径介于微丝和微管之间（711nm） 、由多种不同蛋白组成的细胞骨架 精品文档 精品文档 成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成 网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。 主要起机械支撑和加固作用。组成中间纤维 的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤 维，神经胶质纤维和核纤层蛋白。不同组织来 源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能 不同。 5. 研究细胞骨架的意义。 （1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。 （2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害
4、。 （3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。 6. 显示细胞骨架的常用方法： 考马氏亮蓝染色法、 免疫荧光染色法、 鬼笔环肽标记法。 （1）考马斯亮蓝染色法原理及特点 原理：用去垢剂 Triton X-100 处理细胞适宜时间， 可以溶解膜脂， 并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解， 剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解， 然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。 特点： 非特异蛋白染色， 不能区分微管、 微丝、中间纤维 （2）免疫荧光染色法原理及特点 原理：用 TritonX-100 处理固定处理过 的细胞，可增加细胞膜通透性，使抗体 能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接 着用荧光
5、素标记的抗骨架蛋白抗体便可通 过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法显示 骨架。 特点：特异显示各种骨架蛋白 （3）鬼笔环肽标记法原理及特点 原理：鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白， 因此， 用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。 特点：灵敏，能特异显示微丝。 三、 实验材料、试剂及用品 （一） 材料： 洋葱 （二） 试剂 （1）M-缓冲液。 （2）6mM 磷酸盐缓冲液（pH6.8） 。 （3）含 1%TritonX-100 的 M-缓冲液。 （4）用 M-缓冲液配制的 3.0%戊二醛。 精品文档 精品文档 （5）0.2%考马斯亮蓝 R250 染液。 （6）0.9%氯化钠生理盐水。 （三） 用品 普通光
6、学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（ 37 ） 小剪刀、镊子、5mL 一次性塑料注射器、胶头吸管、1.5mLEP 管、1.5mL 试管架 四、 实验操作 考马斯亮蓝染色法显示洋葱鳞茎内表皮细胞骨架 （1） 材料准备：撕取洋葱鳞茎内表皮，裁成大小 0.5cm.的小片。 （2） PBS 平衡：放入盛有 1mL 6mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）的 EP 管中，静置使材料下沉（完全浸透） ；然后用胶头滴管吸弃液体。 （3） TritonX-100 处理：加 1mL 1% TritonX-100 溶液处理 20min，然后用胶头滴管吸弃液体。 （4） 洗涤：用 M-缓冲液洗涤 3 次，每次加 1.5
7、mL 溶液浸泡 5min，然后用胶头滴管吸弃液体。 （5） 固定：加 1mL 3.0%戊二醛固定 30min,然后用胶头滴管吸弃液体。 （6） 洗涤：用 PBS 洗涤 3 次，每次浸泡 5min,然后用胶头滴管吸弃液体。 （7） 染色：用 0.51.0mL 0.2%考马斯蓝 R250 染液染色 10min。 （8） 洗涤：用蒸馏水洗涤数遍。 （9） 制备装片：给载玻片中央加 1 滴水，用镊子夹取样品在其中展开，然后加盖玻片。 （10） 显微观察：在普通光学显微镜下，洋葱细胞骨架为布满细胞的蓝色网状结构。 （11） 对照样品：省去步骤（3） ，不用 TritonX-100 处理；省去步骤（4）,
8、用TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤。 五、 实验结果及结论 1.实验样品 图 1 洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍） 实验样品的细胞骨架分布细密均匀，视野中只剩下细胞骨架的蛋白质，被考马斯亮蓝染成蓝色。在视野的上半部分，细胞的背景呈现蓝紫色，是由于最后洗涤不彻底所致。 2.对照样品：不用 TritonX-100 处理 精品文档 精品文档 图 2 不用 TritonX-100 处理的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍） 不用 TritonX-100 处理的对照样品的细胞中除了细胞骨架还有很多膜泡结构，细胞中还有蓝色的细胞核。不用 TritonX-100 处理，使得视野中有很多
9、非骨架蛋白，这些非骨架蛋白被考马斯亮蓝染成蓝色，影响对细胞骨架的观察。 3.对照样品：用 TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤 图 3 用 TritonX-100 处理后不用 M-缓冲液洗涤的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400 倍） 图 3 和图 2 的情况类似，视野中没有均匀细密的细胞骨架，这是由于 M-缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在 M 缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂，EGTA 和 EDTA 螯合钙离子，溶液并提供镁离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。 用 TritonX-100 处理后虽然可以溶解膜脂和非细胞骨架蛋白，但是保留下来的骨架蛋白在没有
10、M-缓冲液的作用下，其结构仍无法保持稳定，影响观察结果。 六、 作业与思考题 1. 比较用与不用 1%TritonX-100 处理的实验结果。 答：见五、实验结果与结论部分 1、2。 2 查阅资料说明 M-缓冲液中咪唑、MgCl2、EGTA、EDTA、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）在稳定细胞骨架中的作用。 答：在 M-缓冲液中，咪唑是缓冲剂，MgCl2提供 Mg2+,EGTA 和 EDTA 螯合 Ca2+，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察；巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）可以在二硫键被打开后使蛋白质的四级或三级结构被破坏，由于巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，它常常被用于蛋白
11、质分析，且巯基乙醇也常常被用于保护蛋白质精品文档 精品文档 中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。 3. 设计检测微丝的间接免疫荧光法实验流程。 （1） 用未标记的微丝抗体加到微丝抗原标本上，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。 （2） 加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgG、IgM 抗体，标记的抗球蛋白抗体和已结合抗原的抗体进一步结合。 （3） 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光； （）极弱的可疑荧光； （+）荧光较弱，但清楚可见； （+）荧光明亮； （+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（）或（-） ，即可判定为阳性 七、反思与改进 1. 防止洋葱鳞茎内表皮卷曲、折叠，若卷曲折叠可以在洗涤的过程中慢慢展开，没还展开，在制片时用镊子小心的将内表皮展开。 2TritonX-100 处理时间应足够，处理完洗涤应充分，否则胞内会存在膜泡状结构及其它杂蛋白，干扰骨架染色及观察，尽量保证各组各步处理的时间和方法一致。 3. TritonX-100 处理后各步操作应轻柔，避免容器剧烈震荡及吸管吹打过猛引起骨架蛋白束断裂。
