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1、体外培养的癌细胞的观察和传代培养Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望n 什么是癌细胞？什么是癌细胞？ “不死不死”的永生细胞的永生细胞 癌细胞体外培养的意义？癌细胞体外培养的意义？基础研究；药物筛选；单克隆抗体等基础研究；药物筛选；单克隆抗体等方便；快捷方便；快捷和植物细胞相比和植物细胞相比n动物细胞全能性表达较难动物细胞全能性表达较难动物：组织培养动物：组织培养 细胞培养细胞培养 动物细胞培养简介动物细胞培养简介n n1 基本概念基本概念n n2 培养的基本条件培养的基
2、本条件n n3培养细胞的形态特点培养细胞的形态特点n n4 传代一般方法传代一般方法n n5 实验内容介绍实验内容介绍1 基本概念基本概念n n原原原原代代代代培培培培养养养养：直直直直接接接接从从从从供供供供体体体体取取取取来来来来的的的的细细细细胞胞胞胞，组组组组织织织织或或或或器器器器官官官官进进进进行行行行的的的的初初初初次次次次培培培培养养养养。通通通通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 n n传传传传代代代代培
3、培培培养养养养：原原原原代代代代培培培培养养养养物物物物长长长长成成成成单单单单层层层层细细细细胞胞胞胞达达达达到到到到一一一一定定定定密密密密度度度度时时时时，营营营营养养养养消消消消耗耗耗耗殆殆殆殆尽尽尽尽，需要分开扩大培养，补充营养，使之继续增殖。需要分开扩大培养，补充营养，使之继续增殖。需要分开扩大培养，补充营养，使之继续增殖。需要分开扩大培养，补充营养，使之继续增殖。n n细胞系：细胞系：细胞系：细胞系：可以传代培养的细胞即可成为细胞系。可以传代培养的细胞即可成为细胞系。可以传代培养的细胞即可成为细胞系。可以传代培养的细胞即可成为细胞系。 有限细胞系：正常二倍体。传代有限。有限细胞系
4、：正常二倍体。传代有限。有限细胞系：正常二倍体。传代有限。有限细胞系：正常二倍体。传代有限。 无限细胞系：癌细胞，转化细胞。异倍体；无限传代。无限细胞系：癌细胞，转化细胞。异倍体；无限传代。无限细胞系：癌细胞，转化细胞。异倍体；无限传代。无限细胞系：癌细胞，转化细胞。异倍体；无限传代。2 培养的基本条件培养的基本条件 总原则：模拟体内条件总原则：模拟体内条件 。n n营养营养n n胞外环境胞外环境n n无污染无污染n n其他其他2.1 培养基培养基必要的营养必要的营养n n氨基酸：氨基酸：氨基酸：氨基酸：1212种必需氨基酸种必需氨基酸种必需氨基酸种必需氨基酸n n葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖n
5、n维生素：维持酶功能的稳定。维生素：维持酶功能的稳定。维生素：维持酶功能的稳定。维生素：维持酶功能的稳定。n n无机盐无机盐无机盐无机盐n n血清：生长因子；粘附因子；解毒血清：生长因子；粘附因子；解毒血清：生长因子；粘附因子；解毒血清：生长因子；粘附因子；解毒 1020%1020% 指示剂指示剂指示剂指示剂 酚红酚红酚红酚红 血清的质量是细胞培养的关键血清的质量是细胞培养的关键n小牛血清小牛血清n新生牛血清新生牛血清n胎牛血清胎牛血清n进口的胎牛血清进口的胎牛血清2.2 适宜的胞外条件适宜的胞外条件n n温度：温度：哺乳类哺乳类 3537度。度。n n气体：气体：95%空气，空气，5%CO2
6、。 CO2的作用的作用。n nPH: 7.27.4。 NaHCONaHCO3 3 Na Na+ + + HCO3+ HCO3- - +H+H2 2O NaO Na+ + +H+H2 2CO3 +OHCO3 +OH- - 2.3 无污染无污染n实验用品、培养基和试剂等的除菌消毒实验用品、培养基和试剂等的除菌消毒n操作环境的灭菌消毒操作环境的灭菌消毒n实验操作实验操作超净工作台超净工作台l风风 机机l紫外照紫外照射射30分分钟钟l在酒精在酒精灯附近灯附近操作操作2 培养的基本条件培养的基本条件 总原则：模拟体内条件总原则：模拟体内条件 。n n营养营养n n胞外环境胞外环境n n无污染无污染n n
7、其他：其他：平衡盐溶液的使用：平衡盐溶液的使用：平衡盐溶液的使用：平衡盐溶液的使用：PBS; D-HanksPBS; D-Hanks等。等。等。等。 3 培养细胞的形态特点培养细胞的形态特点n n细胞的生长方式：细胞的生长方式： 贴壁；半贴壁；悬浮贴壁；半贴壁；悬浮n n形态类型：形态类型：成纤维样；上皮样；悬浮；其他成纤维样；上皮样；悬浮；其他成纤维样；上皮样；悬浮；其他成纤维样；上皮样；悬浮；其他成纤维细胞成纤维细胞成纤维细胞成纤维细胞HelaHela细胞细胞细胞细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞神经细胞神经细胞神经细胞神经细胞n n健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少健康细胞
8、的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少, , 伸展性好。伸展性好。伸展性好。伸展性好。n n细胞污染：贴壁细胞脱落，细胞细胞污染：贴壁细胞脱落，细胞细胞污染：贴壁细胞脱落，细胞细胞污染：贴壁细胞脱落，细胞“ “变瘦变瘦变瘦变瘦” ”，胞质颗粒，胞质颗粒，胞质颗粒，胞质颗粒多，培养基中杂质多，甚至可观察到菌；培养液很快多，培养基中杂质多，甚至可观察到菌；培养液很快多，培养基中杂质多，甚至可观察到菌；培养液很快多，培养基中杂质多，甚至可观察到菌；培养液很快变黄，且混浊。变黄，且混浊。变黄，且混浊。变黄，且混
9、浊。n n细胞缺乏营养：细胞致密时即应传代；若未及时传代，细胞缺乏营养：细胞致密时即应传代；若未及时传代，细胞缺乏营养：细胞致密时即应传代；若未及时传代，细胞缺乏营养：细胞致密时即应传代；若未及时传代，细胞细胞细胞细胞“ “变瘦变瘦变瘦变瘦” ”，贴壁细胞变圆脱落，培养液发黄。，贴壁细胞变圆脱落，培养液发黄。，贴壁细胞变圆脱落，培养液发黄。，贴壁细胞变圆脱落，培养液发黄。4 细胞传代一般方法细胞传代一般方法n悬浮：离心，分装。悬浮：离心，分装。n半贴壁：吹打，分装。半贴壁：吹打，分装。n贴壁：消化，吹打，分装。贴壁：消化，吹打，分装。5 实验内容介绍实验内容介绍实验目的实验目的n了解动物细胞培
10、养的一般知识了解动物细胞培养的一般知识n学习细胞的传代技术学习细胞的传代技术n熟悉倒置显微镜的使用并了解显微镜下体熟悉倒置显微镜的使用并了解显微镜下体外培养的动物细胞的形态特点外培养的动物细胞的形态特点n学习超净工作台的使用和无菌操作学习超净工作台的使用和无菌操作实验材料实验材料nHela细胞：宫颈癌上皮细胞；细胞：宫颈癌上皮细胞；1951年成系。年成系。实验试剂实验试剂nDMEM 低糖培养基（低糖培养基（solarbio）n新生牛血清（新生牛血清（solarbio）n胰蛋白酶（胰蛋白酶（Amresco）2.5g/L胰蛋白酶消化液：用胰蛋白酶消化液：用PBS缓冲液配制，缓冲液配制，pH7.4n
11、水：去离子的双蒸水水：去离子的双蒸水实验步骤实验步骤n观察观察 倒置显微镜：物镜与照明系统颠倒，物镜倒置显微镜：物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下。在载物台之下。 健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少杂质少, 伸展性好。伸展性好。n传代细胞：传代细胞：1传传3n在镜下观察细胞密度及形态，待细胞长满连成一片即可传代。在镜下观察细胞密度及形态，待细胞长满连成一片即可传代。n倒掉旧培养基，加胰酶润洗一下，再加胰酶消化倒掉旧培养基，加胰酶润洗一下，再加胰酶消化2-3分钟左右。分钟左右。n沿无细胞面倒掉胰酶，加沿无细胞面倒掉胰酶，加4-5ml左右的培养基，充分吹打，镜下观察是否还有左右的培养基，充分吹打，镜下观察是否还有贴壁细胞。贴壁细胞。n分装于三个小培养瓶，补齐培养基约分装于三个小培养瓶，补齐培养基约5ml/瓶。瓶。n拧上盖子，勿拧太紧，平放于培养箱中。拧上盖子，勿拧太紧，平放于培养箱中。
